文庫(kù)片段篩選技術(shù)流程

磁珠進(jìn)行核酸片段篩選的步驟基于SPRI技術(shù)和磁場(chǎng)分離原理，通過(guò)磁珠與DNA片段的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)目標(biāo)片段的分離。以下是具體操作流程及關(guān)鍵要點(diǎn)： 一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1. ​磁珠平衡
   將磁珠從冰箱取出，室溫平衡至少30分鐘，避免低溫破壞表面修飾基團(tuán)。
2. ​試劑配制
   • 現(xiàn)用現(xiàn)配80%無(wú)水乙醇（體積比8:2）。
   • 根據(jù)目標(biāo)片段大小選擇磁珠比例（參考各廠家磁珠分選比例表）。

二、雙輪分選法（適用于NGS文庫(kù)構(gòu)建）
​第一輪：去除大片段（右側(cè)清除）​

1. ​磁珠與樣本混合
   按比例（如0.8×）加入磁珠至DNA溶液中，渦旋混勻或移液器吹打10次，室溫孵育5分鐘。
2. ​磁場(chǎng)分離
   短暫離心后置于磁力架（如達(dá)遠(yuǎn)辰光磁力架），待溶液澄清（約5分鐘），轉(zhuǎn)移上清至新管，殘留2μL液體于原管底部，避免吸到磁珠。

​第二輪：去除小片段（左側(cè)清除）​

1. ​加入第二輪磁珠
   按比例（如0.2×）加入磁珠至第一輪上清中，重復(fù)混勻、孵育步驟。
2. ​磁場(chǎng)分離與洗脫
   • 分離后棄上清，用80%乙醇漂洗磁珠2次（每次30秒）。
   • 室溫干燥磁珠至剛出現(xiàn)龜裂（約5分鐘），避免過(guò)度干燥。
   • 加入ddH₂O或TE洗脫DNA，室溫孵育5分鐘后回收上清。

三、單側(cè)分選法（適用于去除短片段）

1. ​調(diào)整磁珠比例
   根據(jù)目標(biāo)片段長(zhǎng)度選擇磁珠用量（如去除≥1000bp片段用0.6×，去除≥200bp用2.0×）。
2. ​結(jié)合與分離
   • 混勻磁珠與樣本后孵育5分鐘，磁力架分離并棄上清。
   • 乙醇漂洗后洗脫DNA，適用于去除引物二聚體或短片段雜質(zhì)。

四、關(guān)鍵注意事項(xiàng)

1. ​分選精度控制
   • 第一輪棄磁珠，第二輪棄上清，確保目標(biāo)片段被保留。
   • 使用Qsep、Agilent 2100 Bioanalyzer驗(yàn)證分選后片段分布。
2. ​操作誤差規(guī)避
   • 轉(zhuǎn)移上清時(shí)使用200μL+10μL槍頭，防止吸到磁珠。
   • 初始體積≥100μL，不足時(shí)補(bǔ)超純水以減少移液誤差。

五、應(yīng)用場(chǎng)景示例

• ​NGS文庫(kù)構(gòu)建：通過(guò)雙輪分選獲得300-500bp目標(biāo)片段。
• ​病原體檢測(cè)：快速分離特定長(zhǎng)度的病毒核酸片段。

如需具體磁珠比例表或?qū)嶒?yàn)參數(shù)，可參考廠商提供的說(shuō)明書（如UltraBio™ II DNA磁珠分選指南）。