納米——厘米跨尺度成像技術(shù)在腦科學(xué)研究中的進(jìn)展

大腦結(jié)構(gòu)的尺度跨越極大，從納米級(jí)的突觸到厘米級(jí)的整個(gè)大腦，要想全面解析大腦的連接奧秘，就需要一種能夠跨越多個(gè)空間尺度的成像技術(shù)。日本聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)在《iScience》發(fā)表了突破性成果，研究人員開發(fā)出一種結(jié)合組織透明化方法（ScaleSF）與連續(xù)光鏡/電鏡（LM/EM）成像的多尺度神經(jīng)元成像技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)了從全腦宏觀觀察到突觸納米結(jié)構(gòu)解析的無縫銜接，為揭示神經(jīng)環(huán)路的跨尺度組織規(guī)律提供了革命性工具。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
在神經(jīng)連接組學(xué)研究領(lǐng)域，光鏡與電鏡技術(shù)長(zhǎng)期處于割裂狀態(tài)。熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合組織透明化方法（如CUBIC、CLARITY）雖能實(shí)現(xiàn)全腦尺度的神經(jīng)元追蹤，但受光學(xué)衍射極限制約，無法確認(rèn)直徑僅300納米的突觸連接。而基于連續(xù)切片電鏡的技術(shù)雖能重建突觸級(jí)連接，卻因成像通量限制僅能分析毫米級(jí)組織塊。這種技術(shù)鴻溝導(dǎo)致研究者無法在同一樣本中同時(shí)獲取神經(jīng)環(huán)路的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與突觸連接特性。更嚴(yán)峻的是，傳統(tǒng)透明化方法使用的強(qiáng)去垢劑會(huì)破壞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，而電鏡兼容的固定劑戊二醛又會(huì)淬滅熒光信號(hào)，使得多尺度成像的技術(shù)整合舉步維艱。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
研究團(tuán)隊(duì)通過三重技術(shù)突破構(gòu)建了多尺度成像體系。首先開發(fā)的ScaleSF透明化方法，在保持樣本尺寸穩(wěn)定的前提下，將1mm厚腦片的透光率提升至90%以上，其次設(shè)計(jì)的雙模態(tài)探針，通過酪胺信號(hào)放大系統(tǒng)在透明化處理后仍保持強(qiáng)電鏡對(duì)比度，軸向標(biāo)記分辨率達(dá)250nm。最后構(gòu)建的高效表達(dá)系統(tǒng)使探針在神經(jīng)元胞體與軸突末梢的標(biāo)記強(qiáng)度提升4.7倍，支持從全腦追蹤到單突觸解析的連續(xù)觀測(cè)。

該技術(shù)體系成功應(yīng)用于三個(gè)典型神經(jīng)環(huán)路研究。在小鼠紋狀體-蒼白球通路中，研究人員首次通過連續(xù)成像證實(shí)了紋狀體投射神經(jīng)元的無髓鞘特性；狨猴皮層-紋狀體環(huán)路的全腦成像則揭示了靈長(zhǎng)類特有的突觸分布規(guī)律；最引人注目的是小鼠胼胝體環(huán)路研究，證明了該技術(shù)在稀疏連接解析中的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

成像實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析
成像實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
在驗(yàn)證多尺度成像技術(shù)可行性的實(shí)驗(yàn)中，研究人員精心設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)方案。他們選擇了小鼠紋狀體傳出系統(tǒng)、小鼠胼胝體系統(tǒng)以及狨猴皮質(zhì)紋狀體投射系統(tǒng)作為研究對(duì)象。這些系統(tǒng)在大腦功能中具有重要作用，且其神經(jīng)連接的復(fù)雜性和多樣性能夠充分檢驗(yàn)成像技術(shù)的性能。

為了實(shí)現(xiàn)對(duì)不同尺度結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)追蹤，研究人員采用了多種標(biāo)記方法。利用GFP和RFP熒光、DAB-Ni²標(biāo)記以及大腦結(jié)構(gòu)形狀、血管和細(xì)胞核等內(nèi)源性標(biāo)志物，確保在不同成像尺度下都能準(zhǔn)確識(shí)別和追蹤目標(biāo)結(jié)構(gòu)。同時(shí)實(shí)現(xiàn)了光鏡和電鏡數(shù)據(jù)集的明確關(guān)聯(lián)。

小鼠紋狀體傳出系統(tǒng)成像結(jié)果
以小鼠紋狀體傳出系統(tǒng)為模型，研究人員展示了多尺度成像技術(shù)的強(qiáng)大功能。在實(shí)驗(yàn)中，他們將攜帶載體注射到小鼠的尾狀核-殼核（CPu）。四周后，對(duì)大腦進(jìn)行固定、透明化處理，并利用共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行宏觀和中尺度神經(jīng)回路映射。結(jié)果清晰地觀察到EGFP標(biāo)記的纖維從CPu延伸到腦干，在蒼白球外側(cè)部（GPe）和黑質(zhì)（SN）形成密集的終末場(chǎng)。

進(jìn)一步對(duì)感興趣的神經(jīng)元進(jìn)行重新切片和高分辨率成像，詳細(xì)記錄了標(biāo)記神經(jīng)元的形態(tài)。在GPe神經(jīng)元的樹突上，研究人員確認(rèn)了對(duì)稱突觸的存在，其特征為缺乏突觸后致密物（PSD）和狹窄的突觸間隙。這一結(jié)果不僅驗(yàn)證了成像技術(shù)在解析神經(jīng)回路和突觸連接方面的準(zhǔn)確性，還為深入研究紋狀體傳出系統(tǒng)的功能提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

小鼠胼胝體系統(tǒng)成像結(jié)果
小鼠胼胝體系統(tǒng)的成像實(shí)驗(yàn)聚焦于胼胝體對(duì)新皮質(zhì)中間神經(jīng)元的突觸輸入。在對(duì)透明化腦切片進(jìn)行共聚焦激光掃描顯微鏡成像時(shí)，研究人員觀察到EGFP標(biāo)記的軸突從小鼠初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層穿過胼胝體，投射到對(duì)側(cè)皮層，與標(biāo)記的PV中間神經(jīng)元相互作用。通過仔細(xì)篩選大量的連續(xù)圖像，他們發(fā)現(xiàn)了胼胝體軸突終末與PV新皮質(zhì)中間神經(jīng)元樹突之間的一個(gè)接觸點(diǎn)。經(jīng)過重新切片、復(fù)染和成像，證實(shí)了這個(gè)接觸點(diǎn)確實(shí)形成了突觸連接，且為不對(duì)稱突觸，具有典型的PSD結(jié)構(gòu)。這一結(jié)果展示了多尺度成像技術(shù)在捕捉稀缺突觸接觸方面的卓越能力，為研究大腦半球間的信息傳遞提供了新的視角。

狨猴皮質(zhì)紋狀體投射系統(tǒng)成像結(jié)果
為了驗(yàn)證多尺度成像技術(shù)在大型哺乳動(dòng)物大腦研究中的有效性，研究人員以狨猴為模型，對(duì)其皮質(zhì)紋狀體投射系統(tǒng)進(jìn)行成像。宏觀全腦成像顯示，APEX2表達(dá)標(biāo)記出了神經(jīng)元聚集區(qū)域。對(duì)透明化的腦切片進(jìn)行成像，清晰地觀察到EGFP標(biāo)記的軸突從初級(jí)軀體感覺皮層（S1）延伸到皮層下，并在殼核形成密集的終末場(chǎng)。重新切片后進(jìn)行微觀亞細(xì)胞成像，詳細(xì)記錄了標(biāo)記神經(jīng)元的形態(tài)，包括錐體神經(jīng)元的胞體、樹突和軸突投射。最后，通過成像在納米尺度下觀察到了突觸結(jié)構(gòu)，如不對(duì)稱突觸。這些結(jié)果表明，多尺度成像技術(shù)能夠在狨猴大腦中實(shí)現(xiàn)從宏觀到微觀的有效成像，為研究靈長(zhǎng)類動(dòng)物大腦的神經(jīng)連接提供了有力工具。

總結(jié)與展望
ScaleSF技術(shù)體系的建立標(biāo)志著神經(jīng)成像技術(shù)進(jìn)入多尺度融合的新紀(jì)元。其核心突破在于打破了組織透明化與超微結(jié)構(gòu)保存的互斥困境，這種技術(shù)整合使研究者首次能在同一標(biāo)本中完成腦區(qū)連接圖譜繪制與突觸類型鑒定，為解析神經(jīng)環(huán)路的空間編碼機(jī)制提供了關(guān)鍵工具。在轉(zhuǎn)化應(yīng)用層面，該技術(shù)特別適用于退行性疾病研究，例如在帕金森病模型中同步追蹤黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的大尺度退變過程與突觸超微結(jié)構(gòu)改變。未來，技術(shù)優(yōu)化將聚焦三個(gè)方向：開發(fā)全腦透明化方案以獲取完整投射信息，目前1mm切片導(dǎo)致長(zhǎng)程連接追蹤完整度僅68%；建立多色標(biāo)記體系，通過APEX2變體實(shí)現(xiàn)不同神經(jīng)元類型的突觸特異性標(biāo)記；結(jié)合AI圖像分析，構(gòu)建從全腦到突觸的自動(dòng)化重建流程。隨著相關(guān)技術(shù)的持續(xù)突破，有望在五年內(nèi)實(shí)現(xiàn)厘米級(jí)哺乳動(dòng)物腦的完整連接組解析，最終揭開意識(shí)與認(rèn)知的物質(zhì)基礎(chǔ)之謎。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Furuta T, Yamauchi K, Okamoto S, Takahashi M, Kakuta S, Ishida Y, Takenaka A, Yoshida A, Uchiyama Y, Koike M, Isa K, Isa T, Hioki H. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 2021 Dec 27;25(1):103601.

DOI:10.1016/j.isci.2021.103601.