布里淵顯微鏡技術(shù)在活體生物成像中的研究

生物力學(xué)研究在揭示細(xì)胞功能調(diào)控、組織發(fā)育和疾病機制中具有不可替代的作用。傳統(tǒng)力學(xué)檢測技術(shù)依賴物理接觸或外力加載，難以實現(xiàn)非侵入式三維動態(tài)觀測。布里淵顯微鏡（Brillouin microscopy，BM）的出現(xiàn)帶來了新的希望。近期，發(fā)表于《Nature Methods》的一項研究成果，更是為布里淵顯微鏡技術(shù)帶來了重大突破，首次實現(xiàn)了對斑馬魚幼體、線蟲胚胎等光敏感生物樣本的高分辨率長時間觀測，為活體生物力學(xué)研究開辟了新路徑。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
生物力學(xué)研究的關(guān)鍵意義
過去幾十年，生物力學(xué)領(lǐng)域致力于解開機械力、材料特性和生化信號之間的復(fù)雜關(guān)系。這些因素緊密協(xié)作，共同調(diào)控著細(xì)胞的功能和組織的有序構(gòu)建。例如，細(xì)胞所處微環(huán)境的力學(xué)性質(zhì)會顯著影響細(xì)胞的增殖、分化和遷移等關(guān)鍵行為。在腫瘤的發(fā)展過程中，癌細(xì)胞所處微環(huán)境的力學(xué)變化會促使癌細(xì)胞更具侵襲性，導(dǎo)致腫瘤的擴散。然而，現(xiàn)有的生物物理技術(shù)大多依賴直接物理接觸，需要對樣本施加外力來進(jìn)行測量。這種方式存在明顯的局限性，一方面只能獲取樣本表面的信息，另一方面缺乏在三維空間中對細(xì)胞進(jìn)行高分辨率觀測的能力，無法滿足對生物樣本微觀力學(xué)特性深入研究的需求。

布里淵顯微鏡技術(shù)嶄露頭角
布里淵顯微鏡作為一種新興的光學(xué)彈性成像技術(shù)，為生物力學(xué)研究帶來了新的契機。當(dāng)布里淵顯微鏡與共聚焦顯微鏡結(jié)合后，具備了三維衍射極限分辨率，在生物研究領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景，涵蓋了從活細(xì)胞內(nèi)生物力學(xué)研究到疾病診斷等多個方面。

傳統(tǒng)技術(shù)的困境
盡管布里淵顯微鏡前景光明，但傳統(tǒng)的自發(fā)布里淵散射面臨著信號微弱的難題。為了克服這一障礙，受激布里淵散射（SBS）技術(shù)應(yīng)運而生，實現(xiàn)了高光譜分辨率和高機械特異性，同時縮短了生物樣本的采集時間。然而，目前的SBS技術(shù)也并非完美無缺。通常要求樣本相對透明、厚度小于100-200μm，并且需要從兩側(cè)進(jìn)行光學(xué)訪問，這限制了其適用范圍。此外，現(xiàn)有的SBS需要較高的泵浦功率。高功率照明不僅會導(dǎo)致樣本加熱，產(chǎn)生光毒性，影響樣本的生理狀態(tài)，還限制了對光敏樣本的長時間成像，使得其在生命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用受到阻礙。因此，開發(fā)一種能夠克服這些局限性的新技術(shù)，成為了生物力學(xué)研究領(lǐng)域的迫切需求。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
脈沖SBS技術(shù)原理剖析
為了解決傳統(tǒng)SBS技術(shù)的不足，研究團(tuán)隊提出了脈沖泵浦-探測方法。從原理上看，在連續(xù)波泵浦和探測方案中，SBS信號與泵浦和探測光的平均功率乘積以及相互作用時間成正比；而脈沖方案則有所不同，其信號與脈沖峰值功率的平方以及脈沖寬度成正比。在平均功率相同的情況下，脈沖方案的有效增強因子E與占空比成反比。這意味著在相同激光功率下，脈沖方案能夠獲得更高的信噪比（SNR）。利用這一優(yōu)勢，在保持相同信噪比和探測功率的同時，可以大幅降低泵浦功率，從而減少對樣本的光損傷，為對光敏生物樣本的成像提供了可能。

實驗裝置與優(yōu)化細(xì)節(jié)
研究團(tuán)隊精心搭建了一套脈沖SBS顯微鏡系統(tǒng)。泵浦和探測激光在進(jìn)入樣本前，分別要經(jīng)過一系列復(fù)雜的光學(xué)處理過程。為了使系統(tǒng)性能達(dá)到最佳，研究人員對多個關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了仔細(xì)優(yōu)化，經(jīng)過這些優(yōu)化，該系統(tǒng)在低照明劑量下，也能實現(xiàn)與傳統(tǒng)連續(xù)波SBS相當(dāng)?shù)男旁氡�、光譜分辨率、圖像質(zhì)量和成像速度，為后續(xù)的實驗研究奠定了堅實基礎(chǔ)。

技術(shù)優(yōu)勢與潛在應(yīng)用領(lǐng)域
脈沖SBS技術(shù)展現(xiàn)出了諸多顯著優(yōu)勢。首先，在降低照明功率方面成效顯著，與傳統(tǒng)連續(xù)波SBS相比，能實現(xiàn)超過10倍的功率降低，極大地減少了光毒性，使得對各種光敏生物樣本進(jìn)行長時間成像成為現(xiàn)實。其次，該技術(shù)具備較高的空間分辨率和光譜分辨率，能夠精準(zhǔn)區(qū)分樣本中不同的力學(xué)成分，為深入研究生物樣本的微觀力學(xué)特性提供了有力手段。

在細(xì)胞生物學(xué)中，可以幫助研究人員深入探究細(xì)胞內(nèi)不同細(xì)胞器的力學(xué)性質(zhì)，以及這些性質(zhì)在細(xì)胞生理和病理過程中的變化；在發(fā)育生物學(xué)方面，能夠?qū)崟r監(jiān)測胚胎發(fā)育過程中組織和器官的力學(xué)動態(tài)變化，助力揭示胚胎發(fā)育的奧秘；在疾病研究領(lǐng)域，有助于發(fā)現(xiàn)疾病發(fā)生發(fā)展過程中組織力學(xué)性質(zhì)的改變，為疾病的早期診斷和治療提供新的生物標(biāo)志物和潛在靶點。

成像實驗與結(jié)果分析
小鼠細(xì)胞成像
研究團(tuán)隊率先對小鼠細(xì)胞進(jìn)行了布里淵成像實驗，將脈沖SBS成像結(jié)果與準(zhǔn)連續(xù)波照明下的圖像進(jìn)行對比。結(jié)果令人驚喜，脈沖SBS獲取的布里淵頻移圖呈現(xiàn)出高圖像質(zhì)量和良好的信噪比。借助這一技術(shù)，研究人員能夠清晰分辨出核仁等具有細(xì)微力學(xué)差異的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。通過對光譜數(shù)據(jù)的深入分析，還可以繪制出布里淵頻移、增益和線寬的空間圖，進(jìn)一步展示了該技術(shù)的高成像質(zhì)量和信噪比。

為了評估脈沖SBS對細(xì)胞活力的影響，研究人員用碘化丙啶（PI）對細(xì)胞進(jìn)行染色檢測。結(jié)果顯示，脈沖SBS成像15小時后，細(xì)胞未出現(xiàn)膜和染色體損傷。而連續(xù)波SBS成像雖然能獲得類似的對比度和質(zhì)量，但卻出現(xiàn)了明顯的光損傷跡象。同時，細(xì)胞不同區(qū)域（核仁、核質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)）的布里淵頻移整體升高，這表明樣本可能因光照而發(fā)熱。這些實驗充分表明，在基于SBS的單細(xì)胞成像中，將總照明水平控制在低功率對于確保細(xì)胞活力至關(guān)重要，而脈沖SBS技術(shù)在這方面具有明顯優(yōu)勢。

活體斑馬魚和秀麗隱桿線蟲成像
研究團(tuán)隊對受精后3天的活體斑馬魚幼體尾部進(jìn)行了低功率脈沖SBS成像。斑馬魚幼體尾部圍繞脊索的區(qū)域包含一層超薄且機械剛性高的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），對組織結(jié)構(gòu)起著關(guān)鍵的支撐作用。脈沖SBS圖像清晰地呈現(xiàn)出了包括ECM、脊索和周圍肌肉節(jié)段（包括脊髓區(qū)域）在內(nèi)的多種組織類型。了更好地分析多峰布里淵光譜，研究團(tuán)隊開發(fā)了定制的分析方法和GPU增強擬合管道。借助這些工具，他們在分析ECM區(qū)域時，發(fā)現(xiàn)了布里淵頻移的三峰分布，分別對應(yīng)ECM周圍組織成分以及ECM的兩種聲學(xué)模式。此外，在脊髓中央管區(qū)域，研究人員觀察到雙峰布里淵光譜，分別對應(yīng)腦脊液和可能的搏動纖毛。這一結(jié)果表明，脈沖SBS能夠在衍射極限焦體積內(nèi)和活體內(nèi)精準(zhǔn)識別不同的生物力學(xué)成分，為研究活體組織的力學(xué)特性提供了有力支持。

還對年輕成年期的野生型秀麗隱桿線蟲進(jìn)行了成像研究。結(jié)果顯示，在照明功率降低10倍的情況下，仍能獲得相似的信噪比和整體對比度。在對秀麗隱桿線蟲性腺區(qū)域的高分辨率成像中，發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂核的布里淵頻移在卵母細(xì)胞成熟過程中降低。早期卵母細(xì)胞核中，較低布里淵頻移的核質(zhì)圍繞著較高布里淵頻移的核仁，而在晚期卵母細(xì)胞中，核質(zhì)和核仁區(qū)域的布里淵頻移均降低。這種布里淵頻移的變化與染色質(zhì)從早期到晚期卵母細(xì)胞的壓實增加密切相關(guān)。此外，對活體小鼠胚胎的成像實驗表明，脈沖SBS能夠獲得高質(zhì)量的圖像和亞細(xì)胞細(xì)節(jié)，而連續(xù)波SBS的高功率會捕獲胚胎，導(dǎo)致無法進(jìn)行成像。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了脈沖SBS技術(shù)在活體生物成像方面的優(yōu)勢和潛力。

小鼠乳腺類器官成像
研究團(tuán)隊對小鼠乳腺上皮類器官進(jìn)行了成像研究。在類器官發(fā)育的不同階段（接種單細(xì)胞后48小時、70小時和80小時）進(jìn)行成像后發(fā)現(xiàn)，上皮組織和細(xì)胞在橫向和軸向橫截面中都能清晰分辨。通過量化布里淵線寬，研究人員觀察到類器官管腔在發(fā)育早期（48小時）到晚期（70小時和80小時）線寬出現(xiàn)了約200MHz的短暫降低。這一現(xiàn)象與類器官管腔形成過程中的多種生物學(xué)過程有關(guān)，包括細(xì)胞分裂、膜泡內(nèi)吞以及離子通道和泵在頂膜積累導(dǎo)致的靜水壓力變化等。在80小時的成熟類器官中，軸向橫截面圖像顯示側(cè)上皮的布里淵頻移比上皮的上、下帽高100MHz。總體而言，脈沖SBS成像后類器官仍保持活力，表明該技術(shù)在研究類器官發(fā)育和功能方面具有重要的應(yīng)用價值。

秀麗隱桿線蟲胚胎成像
作為脈沖SBS技術(shù)低光毒性和可視化動態(tài)組織特性能力的最終展示，研究團(tuán)隊對受精后約300分鐘至480分鐘的秀麗隱桿線蟲胚胎進(jìn)行了縱向和二維力學(xué)信息成像。在這個胚胎發(fā)育的關(guān)鍵時期，組織形態(tài)發(fā)生開始，大多數(shù)細(xì)胞分裂已經(jīng)完成。研究團(tuán)隊在視野內(nèi)，以13分鐘的時間間隔獲取二維布里淵時間序列圖像。通過分析這些時間序列數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)胚胎不同部位和發(fā)育階段的布里淵頻移存在明顯差異。在胚胎形態(tài)發(fā)生過程中，較高的布里淵頻移標(biāo)記了胚胎的后部，主要由將形成腸道的內(nèi)胚層細(xì)胞組成。在平均激光功率約27mW的情況下，未觀察到光損傷或光毒性，所有成像的胚胎都經(jīng)歷了抽搐和正常發(fā)育，最終孵化成有活力的幼蟲。這與標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)波SBS（約265mW）形成鮮明對比，連續(xù)波SBS在獲取少數(shù)二維圖像后就會導(dǎo)致胚胎損傷和死亡。這充分表明脈沖SBS技術(shù)在研究胚胎發(fā)育過程中的力學(xué)變化方面具有顯著優(yōu)勢，為深入理解胚胎發(fā)育的力學(xué)機制提供了新的有力工具。

總結(jié)與展望
脈沖激發(fā)布里淵顯微鏡的突破，首次實現(xiàn)了對光敏感樣本的長時程、高分辨觀測，其27mW的安全功率閾值（相當(dāng)于手機閃光燈1%的強度）徹底改變了活體成像的游戲規(guī)則。在斑馬魚脊索中發(fā)現(xiàn)的三重聲學(xué)模式、線蟲胚胎發(fā)育的力學(xué)時序圖譜、以及乳腺類器官管腔形成的粘彈性演變，這些突破性成果預(yù)示著生物力學(xué)研究正從靜態(tài)描述邁向動態(tài)機制解析。未來，與光學(xué)衍射層析技術(shù)的結(jié)合，將實現(xiàn)復(fù)雜模量的絕對定量，建立從分子聚集到組織彈性的完整力學(xué)模型。臨床轉(zhuǎn)化方面，該技術(shù)已展現(xiàn)出透過小鼠顱骨檢測腦組織病變的潛力，或?qū)⒊蔀榘�爾茨海默病早期診斷的新利器。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Yang F, Bevilacqua C, Hambura S, Neves A, Gopalan A, Watanabe K, Govendir M, Bernabeu M, Ellenberg J, Diz-Muñoz A, Köhler S, Rapti G, Jechlinger M, Prevedel R. Pulsed stimulated Brillouin microscopy enables high-sensitivity mechanical imaging of live and fragile biological specimens. Nat Methods. 2023 Dec;20(12):1971-1979. doi: 10.1038/s41592-023-02054-z. Epub 2023 Oct 26. Erratum in: Nat Methods. 2024 May;21(5):922.

DOI:10.1038/s41592-024-02259-w.