使用FIDA篩選技術(shù)一分鐘單濃度獲得親和力Kd的方法介紹

在藥物研發(fā)的漫漫征途中，分子間相互作用的定量分析至關(guān)重要，快速尋找能夠精準(zhǔn)結(jié)合目標(biāo)分子的小分子抑制劑或促進(jìn)劑，一直是科學(xué)家們不懈追求的目標(biāo)。傳統(tǒng)的高通量篩選（HTS）技術(shù)雖能快速篩選大量化合物，但往往只能提供定性或半定量的結(jié)果，且存在大量假陽性和假陰性。傳統(tǒng)定量方法（SPR, BLI, ITC）通常需要重復(fù)測量稀釋系列，以便生成滴定曲線并測量平衡解離常數(shù)（Kd），但這些方法受限于它們在幾十分鐘范圍內(nèi)的中低通量能力，才可獲得單個配體的解離常數(shù)。其中表面等離子共振（SPR）、生物層干涉法（BLI）雖然能夠提供詳細(xì)的結(jié)合親和力和動力學(xué)信息，但基于表面的技術(shù)，需要復(fù)雜的表面化學(xué)優(yōu)化，且對緩沖液兼容性和分析物的表面吸附敏感；等溫滴定量熱法（ITC）雖然是溶液中的技術(shù)，但需要大量的樣品，對于珍貴或稀有的材料不夠?qū)嵱�，這些限制促使科學(xué)家們尋找更高效、更通用的分析技術(shù)。如今，一種名為cSPRING（Continuous Titration Based Spectral Related Intensity Change）的新興技術(shù)，它將FIDA（層流誘導(dǎo)分散分析）與光譜位移技術(shù)相結(jié)合，以在單個濃度樣品中測量Kd，作為一種溶液內(nèi)方法，可將樣品制備時間減少8倍，并且僅需要納克蛋白質(zhì)。cSPRING可在一分鐘內(nèi)通過單濃度樣品測量Kd，突出了其效率和篩選應(yīng)用的潛力，有望對傳統(tǒng)小分子定量篩選市場這一領(lǐng)域帶來新的曙光。

技術(shù)原理
在深入了解 cSPRING 的優(yōu)勢之前，我們先來剖析兩種技術(shù)——cSPRING 和 dSPRING 的實驗設(shè)計和原理。在 dSPRING（離散滴定法）中，研究人員需要準(zhǔn)備一系列不同濃度的分析物溶液，通常通過 2 倍稀釋系列來實現(xiàn)。每個濃度點都需要單獨(dú)測量，生成完整的滴定曲線。實驗中，熒光標(biāo)記的指示劑（如蛋白質(zhì)）與不同濃度的配體混合后，通過Capflex方式進(jìn)行檢測。熒光信號呈高斯分布，通過雙高斯擬合提取擴(kuò)散系數(shù)和熒光強(qiáng)度，最終得到平衡解離常數(shù)（Kd）（Figure 1A）。

cSPRING（連續(xù)滴定法）技術(shù)基于FIDA（層流誘導(dǎo)分散分析）與光譜位移技術(shù)，通過在毛細(xì)管中自動創(chuàng)建連續(xù)的濃度梯度，實現(xiàn)對非共價相互作用的快速定量分析。具體來說，F(xiàn)IDA利用層流條件下熒光溶質(zhì)的濃度分布，精確測定擴(kuò)散系數(shù)和流體動力學(xué)半徑。而cSPRING結(jié)合了FIDA和光譜位移檢測，通過測量熒光團(tuán)的發(fā)射光譜變化來反映分子間相互作用。實驗中只需準(zhǔn)備兩個樣品：一個是完全結(jié)合狀態(tài)（高濃度分析物與指示劑混合），另一個是未結(jié)合狀態(tài)（僅指示劑）。通過在毛細(xì)管中自動創(chuàng)建連續(xù)的濃度梯度，模擬傳統(tǒng)的滴定曲線。配體在毛細(xì)管中以泰勒分散的方式形成時間依賴的濃度分布，而指示劑濃度保持恒定（Figure 1B）。
 

Figure 1 的展示，我們可以清晰地看到 cSPRING 和 dSPRING 在實驗設(shè)計上的關(guān)鍵區(qū)別。dSPRING 更適合高精度的詳細(xì)分析，而 cSPRING 則以其高效、快速的特點，成為高通量篩選的理想選擇。

應(yīng)用案例
文章中，研究人員選擇了雞卵清溶菌酶（HEWL）與三乙酰氨基葡萄糖（NAG3）作為模型體系。HEWL被標(biāo)記上對環(huán)境變化敏感的Cy5熒光染料，當(dāng)NAG3與HEWL結(jié)合時，熒光團(tuán)的微環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致其發(fā)射光譜的比率變化。通過在兩個光譜帶（λ1=663–685 nm和λ2=685–737 nm）中測量熒光強(qiáng)度的比率（F2/F1），研究人員能夠?qū)崟r監(jiān)測結(jié)合過程。

Figure 2 展示了cSPRING技術(shù)在HEWL-NAG3體系中的應(yīng)用。圖2A是一個dSPRING離散滴定曲線，顯示了在不同NAG3濃度下，HEWL與NAG3結(jié)合的比率熒光信號變化，擬合得到的Kd值為7.2±0.7 μM，與文獻(xiàn)報道的10 μM非常接近。圖2B則展示了cSPRING實驗中記錄的熒光信號，通過擬合得到的Kd值為10.4±0.8 μM，與dSPRING的結(jié)果一致。圖2C進(jìn)一步驗證了cSPRING的重復(fù)性和可靠性，三次重復(fù)實驗的Kd值高度一致，平均值為10.4±0.8 μM。

為了進(jìn)一步驗證 cSPRING 技術(shù)的高效性和準(zhǔn)確性，研究人員選擇了牛碳酸酐酶 II（bCAII）作為模型體系。bCAII 是一種廣泛研究的酶，它與多種小分子抑制劑的相互作用已被詳細(xì)表征。

Figure 3 則展示了cSPRING技術(shù)在牛碳酸酐酶II（bCAII）與三種不同抑制劑（乙酰唑胺、呋塞米、4-羧基苯磺酰胺）體系中的應(yīng)用。這些抑制劑的Kd值范圍從20 nM到1 μM，cSPRING技術(shù)能夠快速、準(zhǔn)確地測定這些結(jié)合親和力，并與文獻(xiàn)報道的值高度一致。

Table 1 的數(shù)據(jù)表明，cSPRING 和 dSPRING 在測量非共價相互作用的解離常數(shù)（Kd）時具有高度一致性和可靠性。cSPRING 以其快速、高效、節(jié)省樣品的特點，特別適合高通量篩選和初步評估，而 dSPRING 則適合對單個體系進(jìn)行更詳細(xì)的分析。這些方法與傳統(tǒng)技術(shù)（如 SPR 和 ITC）的比較進(jìn)一步驗證了 cSPRING 的實用性和準(zhǔn)確性。

為了進(jìn)一步突出定量篩選能力，研究人員在更短的毛細(xì)管上進(jìn)行 cSPRING 實驗，且無需額外的清洗步驟，這使得單個平衡解離常數(shù)（Kd）值的測量時間縮短至 45 秒（圖 4）。結(jié)果，對三種抑制劑進(jìn)行三次重復(fù)測量用時不到 7 分鐘，每種抑制劑僅消耗 4.2 微升指示劑溶液。
 

Figure 4 在更短的毛細(xì)管中進(jìn)行的 cSPRING 實驗，將單次測定平衡解離常數(shù)（Kd）的測量時間縮短至 45 秒。A - C 展示了三種不同抑制劑的 cSPRING 信號，以及擬合得到的平衡解離常數(shù)（Kd）和流體動力學(xué)半徑。盡管結(jié)果的準(zhǔn)確性降低，但定量讀數(shù)提供了有價值的信息，并且仍與先前報道的親和力相符。

cSPRING的優(yōu)勢

1. cSPRING技術(shù)的核心優(yōu)勢在于其高通量、快速定量的能力。與傳統(tǒng)的滴定方法相比，顯著提高了實驗效率，由于該方法僅使用兩個樣品，樣品制備時間縮短為原來的八分之一。這為在 96 孔板中定量篩選大量小分子文庫騰出了空間。例如，兩個 96 孔板足以測定 150 多個平衡解離常數(shù)（Kd），而采用離散實驗設(shè)置則需要 1500 多個孔，需要大量的樣品制備工作和相當(dāng)多的樣品量。
2. cSPRING技術(shù)對樣品的需求極低，僅需納克級的蛋白質(zhì)，這對于珍貴或難以獲取的樣品具有重要意義。
3. cSPRING結(jié)合獨(dú)特的FIDA與光譜位移技術(shù)，一方面可在毛細(xì)管中自動創(chuàng)建連續(xù)的濃度梯度，避免了繁瑣的樣品準(zhǔn)備過程，另一方面可避免單獨(dú)光譜位移技術(shù)容易受到背景熒光偽影的影響，而 cSPRING 通過分析高斯信號峰下的面積消除了這個問題，使其不受背景效應(yīng)的影響。

結(jié)論
cSPRING技術(shù)以其高效、快速、精準(zhǔn)的特點，為非共價相互作用的定量分析提供了一種全新的解決方案。它不僅大大減少了樣品準(zhǔn)備時間和實驗成本，還能夠提供與傳統(tǒng)方法相媲美的準(zhǔn)確結(jié)果。對于藥物研發(fā)中的高通量篩選和定量分析，cSPRING無疑是一個極具潛力的工具。

參考文獻(xiàn)
Philipp Willmer et al. "Continuous Titration Based Method for Rapid In‐Solution Analysis of Non‐Covalent Interactions." Chemistry Methods 2025.