如何精準(zhǔn)定量核酸濃度

一、紫外分光光度法（Nanodrop）
原理：核酸的堿基（嘌呤、嘧啶）在260 nm波長處有最大紫外吸收峰，通過吸光值（A260）結(jié)合摩爾吸光系數(shù)計(jì)算濃度。DNA的換算系數(shù)為50 μg/mL，RNA為40 μg/mL。
特點(diǎn)：

• 操作簡便，1分鐘內(nèi)完成檢測。
• 無法區(qū)分DNA/RNA、降解核酸及雜質(zhì)，需結(jié)合A260/A280（>1.8為DNA純品，>2.0為RNA純品）評(píng)估純度。
• 靈敏度較低（≥2 ng/μL），易受游離核苷酸干擾。

二、熒光染料法（如達(dá)遠(yuǎn)辰光熒光計(jì)）
原理：特異性熒光染料（與目標(biāo)核酸結(jié)合后發(fā)出熒光，通過熒光強(qiáng)度定量。例如，達(dá)遠(yuǎn)辰光熒光計(jì)搭配賽默飛Qubit dsDNA HS染料檢測范圍為0.2–100 ng/μL。
特點(diǎn)：

• 靈敏度高（pg級(jí)），特異性強(qiáng)，可區(qū)分DNA/RNA。
• 耗材成本相較于紫外分光法較高。
• 適用于低濃度/珍貴樣本（如NGS文庫）。

三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）
原理：通過熒光染料或探針實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR擴(kuò)增過程，Ct值與起始模板濃度呈線性關(guān)系，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。
特點(diǎn)：

• 特異性高，依賴引物/探針設(shè)計(jì)，可檢測拷貝數(shù)。
• 操作復(fù)雜，耗時(shí)較長，需標(biāo)準(zhǔn)品確保擴(kuò)增效率一致。
• 適用于基因表達(dá)分析、病原體檢測等。

四、傳統(tǒng)化學(xué)法

1. ​定磷法
   • ​原理：核酸中的磷在酸性條件下與鉬酸銨反應(yīng)生成鉬藍(lán)，在650 nm處測吸光值，換算濃度。DNA/RNA含磷量分別為9.2%和9.5%。
   • ​特點(diǎn)：靈敏度較高（1–10 μg），但易受蛋白質(zhì)干擾。
2. ​定糖法
   • ​原理：核酸戊糖經(jīng)酸解生成醛類，與成色劑（如苔黑酚）反應(yīng)顯色，670 nm或595 nm測吸光值。
   • ​特點(diǎn)：操作簡單，但特異性差，僅適用于粗略估算。

五、其他方法

1. ​毛細(xì)管電泳法
   • ​原理：基于熒光染料結(jié)合核酸，通過遷移時(shí)間和峰面積定量，可評(píng)估核酸完整性（如RNA降解程度）。
   • ​特點(diǎn)：靈敏度高（25 ng/μL），但單樣成本較高。
2. ​數(shù)字PCR（dPCR）​
   • ​原理：將樣本分割成微滴獨(dú)立擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)陽性微滴數(shù)實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，不受擴(kuò)增效率影響。
   • ​特點(diǎn)：適用于稀有突變檢測、病毒載量測定等。

選型建議

• ​常規(guī)檢測：優(yōu)先選擇紫外分光光度法​（快速便捷）或Qubit熒光法​（高靈敏度）。
• ​復(fù)雜樣本：如NGS文庫，推薦毛細(xì)管電泳或數(shù)字PCR。

​絕對(duì)定量需求：使用qPCR或數(shù)字PCR