納米流式技術(shù)在單顆粒水平定量分析sEVs表面的唾液酸中的應(yīng)用

小細(xì)胞外囊泡(small extracellular vesicles, sEVs)是由細(xì)胞分泌的納米級脂膜囊泡，其表面覆蓋著一層聚糖。這層聚糖不僅維持了sEVs的表面特性，還參與了包括細(xì)胞攝取、免疫調(diào)控及癌癥發(fā)展等關(guān)鍵生理和病理過程。唾液酸(sialic acids, SAs)作為聚糖鏈末端的酸性九碳糖，因其位置特殊性成為感知胞外環(huán)境的“前哨分子”，在調(diào)控細(xì)胞間相互作用、病原體識別以及表面電荷分布中發(fā)揮關(guān)鍵作用。盡管sEVs相關(guān)的蛋白和核酸已被廣泛研究，但其聚糖修飾的研究仍亟待深入探索。鑒于sEVs亞群的高度多樣性及其功能特異性，單顆粒水平的表征解析其組成和生物學(xué)功能具有重要意義。2024年7月24日，廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院顏曉梅教授課題組在Analytical Chemistry上發(fā)表了一篇題為：“Surface Sialic Acid Detection of Small Extracellular Vesicles at the Single-Particle Level by Nano-Flow Cytometry”的研究論文，報道了基于自主研發(fā)的納米流式檢測裝置(nano-flow cytometer, nFCM)實現(xiàn)單顆粒水平sEVs表面唾液酸原位標(biāo)記和分析的新方法。

一、PALEV-nFCM方法開發(fā)
本研究受溫和偏高碘酸鈉氧化聯(lián)合苯胺催化的肟連接(periodate oxidation and aniline-catalyzed oxime ligation, PAL)策略的啟發(fā)，開發(fā)了一種針對小細(xì)胞外囊泡表面唾液酸的特異性化學(xué)標(biāo)記方法(PALEV)，并結(jié)合nFCM技術(shù)，實現(xiàn)了在單顆粒水平對sEV表面衍生化SAs分布的檢測。首先，通過超速離心法從正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞系CCD-18Co中分離出sEVs，并利用透射電子顯微鏡(TEM)確認(rèn)其典型囊泡形態(tài)（圖1A）。nFCM分析顯示粒徑主要分布于40-200 nm（圖1B）。此外，Western Blot驗證了sEVs中存在經(jīng)典的sEV標(biāo)志物CD9和TSG101，而無內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)標(biāo)志物Calnexin（圖1C）。綜上結(jié)果表明，CCD-18Co sEVs的回收率和純度均滿足后續(xù)分析需求。

基于PALEV策略，首先通過溫和的過碘酸鹽氧化在SA的C-7位點引入醛基，隨后利用苯胺催化醛基與XFD488羥胺熒光染料的肟連接反應(yīng)（圖1D）。最終，通過nFCM檢測XFD488陽性比例和平均熒光強(qiáng)度(MFI)。結(jié)果顯示，在最優(yōu)條件下，XFD488陽性sEVs的比例與經(jīng)典凝集素標(biāo)記法相當(dāng)（圖1E-H），且MFI顯著提升，證實了該策略的高效性。

圖1. PALEV-nFCM法對sEVs表面SAs的標(biāo)記與表征

二、PALEV-nFCM方法可靠性驗證
為了驗證PALEV標(biāo)記方法的可靠性，研究者合成了含不同比例DSPE-PEG2k-SA的脂質(zhì)體（100 nm）模型（圖2A(i)）。結(jié)果顯示，隨著DSPE-PEG2k-SA摩爾比的增加，XFD488+脂質(zhì)體的比例逐漸上升，最高可達(dá)94.0%（圖2A-B），與Triton X-100法測定的純度（93.5%）高度一致。此外，MFI分析表明，單個脂質(zhì)體表面的SA含量與修飾濃度呈正相關(guān)（圖2C-D）。

進(jìn)一步，研究者將5% DSPE-PEG2k-SA修飾的脂質(zhì)體與空白脂質(zhì)體按不同比例混合，結(jié)果顯示混合脂質(zhì)體中SA修飾的比例與XFD488+比例之間呈現(xiàn)出高度的線性相關(guān)性（圖2E-F），表明PALEV策略能夠高效且定量地標(biāo)記SA修飾的脂質(zhì)體。

綜上所述，PALEV-nFCM法可實現(xiàn)SA修飾的準(zhǔn)確定量，為后續(xù)sEV的分析奠定基礎(chǔ)。

圖2. 脂質(zhì)體模型驗證PALEV標(biāo)記方法的可靠性

三、PALEV-nFCM方法特異性驗證
為了驗證PALEV標(biāo)記方法的特異性，研究者首先利用神經(jīng)氨酸酶酶解末端SA殘基。nFCM原始脈沖信號峰數(shù)據(jù)顯示，酶處理組的側(cè)向散射通道(SSC)和熒光通道(FL)的信號事件數(shù)(橙色星號)較未處理組顯著減少（圖3A），且XFD488+比例也呈現(xiàn)降低趨勢（圖3B）。這表明PALEV標(biāo)記方法具有較高的特異性。

此外，研究者還觀察到僅顯示FL信號的零星事件（藍(lán)色星號）。這些信號可能來源于共分離污染物或粒徑過小的EV亞群。最新研究表明，TEM結(jié)合免疫金標(biāo)記證明了共分離的伴隨物質(zhì)上存在糖類。這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了對整體平均方法所得數(shù)據(jù)進(jìn)行謹(jǐn)慎解釋的重要性，因為這些方法可能無法區(qū)分潛在的污染物貢獻(xiàn)，而nFCM可以通過SSC觸發(fā)排除此干擾。

進(jìn)一步地，研究者對其他三種不同細(xì)胞系(HCT116、MRC-5和A549)的sEVs進(jìn)行了唾液酸化狀態(tài)分析。結(jié)果顯示，這些細(xì)胞系的sEVs均表現(xiàn)出與CCD-18Co-sEVs相似的唾液酸化模式（圖3C-D）。最后，研究者在細(xì)胞中加入唾液酸化代謝抑制劑(p-3Fax-Neu5Ac)，nFCM結(jié)果顯示，XFD488+比例和MFI都顯著降低（圖3E-G），這進(jìn)一步確認(rèn)了該標(biāo)記方法的特異性。

圖3. PALEV標(biāo)記方法的特異性評估

四、PALEV-nFCM方法普適性驗證
研究者進(jìn)一步將該方法應(yīng)用于唾液和紅細(xì)胞來源sEVs的SA分布分析。nFCM檢測發(fā)現(xiàn)，相比于細(xì)胞來源的sEVs，唾液來源的sEVs具有較高的SA陽性比例（66.6%），且不同供體間的SA比例存在顯著的個體差異（圖4A-C），提示唾液酸化修飾在個體間具有高度異質(zhì)性。

在RBC-sEVs分析中，研究者發(fā)現(xiàn)，鈣離子載體刺激后，紅細(xì)胞分泌的sEVs數(shù)量顯著增加，且SA亞群比例以及單個sEVs的SA含量均明顯上升（圖4D-F）。與此同時，紅細(xì)胞表面SA豐度同步下降。這些結(jié)果揭示了sEVs分泌與細(xì)胞表面糖基化調(diào)控的動態(tài)平衡機(jī)制。

綜上結(jié)果表明，PALEV-nFCM方法具有廣泛的適用性，不僅適用于合成的SA修飾脂質(zhì)體，還適用于多種來源的sEVs，包括細(xì)胞培養(yǎng)上清、人唾液和人紅細(xì)胞。此外，本研究首次在單顆粒水平系統(tǒng)地揭示了EVs表面聚糖修飾的高度異質(zhì)性，不同來源sEVs的SA比例和強(qiáng)度均具有顯著差異。

圖4. PALEV標(biāo)記方法的普適性驗證

研究意義
本研究構(gòu)建的PALEV-nFCM方法是糖鏈分析領(lǐng)域的一項重大突破，實現(xiàn)了在單顆粒水平對sEVs表面唾液酸的高通量、多參數(shù)定量分析。該方法突破了傳統(tǒng)集群平均法的局限，為解析sEVs聚糖異質(zhì)性及其功能關(guān)聯(lián)提供了全新的技術(shù)手段。它不僅具有高特異性，還展示出廣泛的適用性。它不僅深化了對sEVs生物學(xué)功能的理解，還為創(chuàng)新的診斷與治療策略奠定了技術(shù)支持和理論基礎(chǔ)。