Pak2在心臟應(yīng)激和肥厚相關(guān)室性心律失常中的保護作用研究

研究背景：

心源性猝死（SCD）在心血管疾病死亡中占比較高，惡性室性心律失常是其常見病因，由心肌在結(jié)構(gòu)或功能壓力下發(fā)生的結(jié)構(gòu)和電生理重塑引起。以往研究顯示：線粒體功能障礙與心律失常發(fā)生相關(guān)，ATP合成減少、ROS生成增加會引發(fā)細胞和離子功能異常從而導(dǎo)致心律失常。ROS通過氧化并激活Ca²⁺/鈣調(diào)素依賴性激酶II（CaMKII）誘發(fā)心律失常。曾有報道表明Pak1激活的信號通路可保護心肌細胞免受缺血和肥大應(yīng)激，其引發(fā)的肌膜和線粒體功能失調(diào)可能成為改善心律失常的治療靶點。

新研究發(fā)現(xiàn)Pak2參與心臟穩(wěn)態(tài)的細胞調(diào)節(jié)，是離子通道活性、鈣處理和心臟收縮的關(guān)鍵。心臟特異性缺失Pak2的小鼠在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或壓力超負荷時會出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)缺陷、心臟功能障礙和心肌細胞死亡，基因芯片分析顯示這涉及IRE1/XBP1信號通路。而誘導(dǎo)Pak2激活可改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能和心臟性能，減少細胞凋亡并預(yù)防心力衰竭，這些發(fā)現(xiàn)暗示Pak2介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)在心肌肥厚中具有心臟保護作用。

當前缺失Pak2在線粒體氧化應(yīng)激和心臟損傷中保護作用的直接證據(jù)，基于此，西南醫(yī)科大學(xué)譚曉秋/雷鳴/張春祥教授團隊在Advanced Science雜志發(fā)表題為"P21-Activated Kinase 2 as a Novel Target for Ventricular Tachyarrhythmias Associated with Cardiac Adrenergic Stress and Hypertrophy"的文章，揭示了Pak2在心臟腎上腺素應(yīng)激和肥厚相關(guān)的室性心律失常中的關(guān)鍵作用和干預(yù)價值，Pak2是開發(fā)新型有效抗心律失常藥物的潛在靶點。

研究方法：
本研究通過高分辨熒光標測（optical mapping）技術(shù)比較Langendorff灌注的Pak2^cko 和Pak2^f/f 心臟及心肌細胞的APD、CaT等電生理指標的變化；此外，同時對不同組小鼠心臟電交替、異位搏動、折返激動等現(xiàn)象進行監(jiān)測。

研究結(jié)果：
1. Pak2缺失破壞Ca²⁺穩(wěn)態(tài)并增加室性心律失常的易感性
探究在急性異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟腎上腺素能應(yīng)激和慢性TAC致心室肥厚情況下，Pak2信號傳導(dǎo)對心室致心律失常傾向的保護作用。對比Pak2缺失（Pak2^cko）和Pak2^f/f小鼠在有無TAC應(yīng)激時體內(nèi)外心臟電穩(wěn)定性和鈣離子處理情況。結(jié)果顯示，正常狀態(tài)下兩組小鼠部分心電指標相似，但Pak2^cko小鼠QT間期延長；急性異丙腎上腺素應(yīng)激下，Pak2^cko小鼠室性心動過速發(fā)生率更高；TAC處理5周后，Pak2表達下調(diào)，且Pak2^cko/TAC小鼠心臟肥厚和功能障礙更嚴重，室性異位搏動和VT/VF發(fā)生次數(shù)增多，同時其總體生存率因Pak2缺乏和TAC刺激聯(lián)合作用而顯著降低。

圖1. 心臟Pak2的缺失增加了小鼠在急性異丙腎上腺素或慢性TAC刺激下的心律失常易感性

進一步通過高分辨熒光標測（optical mapping）及膜片鉗等技術(shù)，比較了Langendorff灌注的Pak2^cko和Pak2^f/f心臟及心肌細胞的電生理變化。基礎(chǔ)狀態(tài)下兩組心臟室性心律失常發(fā)生率無差異，但急性異丙腎上腺素刺激使Pak2^cko心臟VT發(fā)生率增加，且 Pak2^cko/TAC心臟室性心律失常發(fā)生率更高。

Pak2^cko及Pak2^cko/TAC心臟和心肌細胞的APD和CaT增加。TAC和Pak2缺失使鈣交替發(fā)生率和頻率增加，且加劇了異丙腎上腺素對鈣交替頻率的影響，同時Pak2缺乏加劇了TAC誘導(dǎo)的Vm/CaT延遲增加。Pak2^cko/TAC心臟出現(xiàn)APD交替，引發(fā)異位搏動、折返激動及折返路徑形成，且不同異位搏動位點會改變動作電位傳導(dǎo)方向，形成折返性心律失常路徑。

圖2. 心臟Pak2的缺失加劇了TAC處理后離體心臟室性心律失常和鈣交替的易感性

2. Pak2過表達可緩解異丙腎上腺素或TAC誘導(dǎo)的心律失常
作者構(gòu)建了可誘導(dǎo)心臟特異性過表達野生型Pak2的小鼠Pak2^ctg模型。超聲心動圖顯示該模型和對照小鼠心臟功能正常。Pak2^ctg小鼠經(jīng)異丙腎上腺素刺激后，室性心律失常發(fā)生率和持續(xù)時間降低；TAC處理7周，對照小鼠室性異位搏動頻率大幅增加，而Pak2^ctg/TAC組小鼠室性異位搏動頻率顯著降低，且Pak2激活抑制了壓力超負荷誘導(dǎo)的心肌肥厚。

在電生理和鈣離子相關(guān)指標上，Pak2^ctg/TAC心臟未出現(xiàn)如Pak2^cko心臟類似的膜電位、鈣離子光學(xué)標測重構(gòu)以及鈣交替，而WT/TAC心臟則顯示出有折返激動形成、折返現(xiàn)象以及異常鈣離子處理與膜電位耦合的特征。

圖3. 心臟特異性Pak2過表達可減弱異丙腎上腺素或TAC誘導(dǎo)的心律失常和Ca²⁺交替發(fā)生

3. 分離的單個Pak2^cko心室肌細胞表現(xiàn)出異常的鈣離子動態(tài)變化
接下來，作者研究了Pak2^cko、Pak2^cko/TAC、Pak2^f/f和Pak2^f/f/TAC心室肌細胞中的Ca²⁺瞬變。急性異丙腎上腺素和慢性5周TAC刺激心臟中的Pak2^cko肌細胞比相應(yīng)的對照組顯示出更高的自發(fā)Ca²⁺瞬變（SCT）和Ca²⁺振蕩（CO）的發(fā)生率。此外，Pak2^cko/TAC心肌細胞顯示Ca²⁺瞬變衰減時間常數(shù)明顯延長。

圖4. Pak2的缺失加重了異丙腎上腺素和TAC誘導(dǎo)的心臟細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的破壞

4. Pak2^cko心臟中線粒體生物合成缺陷和氧化磷酸化
為了確定潛在的信號通路，作者對Pak2^cko、Pak2^cko/TAC、Pak2^f/f和Pak2^f/f/TAC小鼠的心室組織進行了蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

多組比較發(fā)現(xiàn)大量差異表達蛋白與心臟應(yīng)激相關(guān)，Pak2^cko/TAC小鼠應(yīng)激相關(guān)蛋白水平升高。KEGG和GO富集分析顯示Pak2^cko/TAC心臟氧化磷酸化相關(guān)代謝途徑富集。進一步分析表明不同組間蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白質(zhì)有顯著差異及部分重疊，且蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)變化存在顯著相關(guān)性，對差異蛋白富集分析后發(fā)現(xiàn)氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)通路相關(guān)蛋白在兩種組學(xué)中的表達趨勢高度一致。

研究運用WGCNA（加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析） 方法探究與樣本表型相關(guān)的蛋白質(zhì)及磷酸化蛋白質(zhì)模塊。對四組蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)處理后，構(gòu)建加權(quán)網(wǎng)絡(luò)并經(jīng)層次聚類分析得到五個蛋白質(zhì)模塊，這些模塊以不同的顏色命名，如藍色模塊，黃色模塊等，其中青綠色模塊與表型嚴重程度顯著相關(guān)。對其進行KEGG和GO通路富集分析，發(fā)現(xiàn)與心肌病、氧化磷酸化等過程有關(guān)。同樣用該方法分析磷酸化蛋白質(zhì)模塊，經(jīng)層次聚類得到18個模塊，青綠色模塊與表型嚴重程度顯著相關(guān)，富集分析顯示其與心肌病和三羧酸循環(huán)有關(guān)。

圖5. Pak2缺失加重了TAC誘導(dǎo)的心臟氧化應(yīng)激

本研究對不同組（Pak2^f/f/TAC、Pak2^cko/TAC及相應(yīng)假手術(shù)組）的氧化應(yīng)激、線粒體結(jié)構(gòu)和功能進行探究。發(fā)現(xiàn)TAC誘導(dǎo)的慢性心臟應(yīng)激使 Pak2^f/f/TAC和Pak2^cko/TAC組ROS水平顯著高于假手術(shù)組，且Pak2^cko/TAC組ROS水平高于 Pak2^f/f/TAC組。通過透射電鏡觀察到 Pak2^cko/TAC心肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)異常更突出，同時該組ATP生物合成顯著減少，與線粒體形態(tài)變化相符。

通過差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與應(yīng)激相關(guān)的蛋白質(zhì)在線粒體中最為富集。對比不同組小鼠，Pak2^cko/TAC小鼠線粒體中差異蛋白數(shù)量與其他組存在差異。進一步分析顯示，Pak2^cko/TAC心臟的線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物I-V顯著少于其余三組，且其復(fù)合物I （NDUFs）的表達和活性顯著下調(diào)。同時表明，單獨的Pak2缺乏不足以導(dǎo)致明顯的損傷。

5. NOX4/ROS介導(dǎo)的CaMKII通路激活有助于Pak2在TAC誘導(dǎo)的心臟電重構(gòu)中的作用
電生理實驗發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)鈣離子動態(tài)、膜電位-鈣信號耦連異常，進一步對比不同組心臟中相關(guān)蛋白表達。結(jié)果顯示，Pak2^cko/TAC心臟中NOX4顯著增加，不同組NOX2表達相似；Pak2^cko/TAC小鼠的ox-CaMKII、p-CaMKII表達和ROS水平高于Pak2^cko小鼠，Pak2^f/f/TAC小鼠也高于Pak2^f/f小鼠，且Pak2基因敲除加劇異丙腎上腺素刺激對NOX4、CaMKII和ROS產(chǎn)生的影響。測量耗氧率發(fā)現(xiàn)，TAC處理降低了氧氣消耗率（OCR），Pak2基因敲除加重了TAC誘導(dǎo)的線粒體功能障礙。

圖6. Pak2缺失通過損害線粒體功能從而加重心功能障礙

6. Pak2過表達可挽救異丙腎上腺素和TAC誘導(dǎo)的線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷
對比Pak2^ctg、Pak2^ctg/TAC、Pak2WT和Pak2WT/TAC的實驗表明，與Pak2^cko相比，Pak2過表達減少了ROS的產(chǎn)生，改善了TAC引起的線粒體變化。Pak2^ctg/TAC心肌細胞顯示線粒體異常數(shù)量減少。作者研究了NOX4/ROS/CaMKII通路可能參與Pak2過表達的心臟保護作用。Pak2^ctg/TAC心肌細胞的NOX4、ox-和p/t-CaMKII表達低于Pak2WT/TAC心肌細胞。最后，即使在異丙腎上腺素濃度加倍的情況下，急性異丙腎上腺素激發(fā)的Pak2^ctg心臟中ROS生成和p-CaMKII表達的增加也低于Pak2WT，表明Pak2過表達可能通過 NOX4/ROS/CaMKII信號通路發(fā)揮心臟保護作用。

圖7. 心臟特異性Pak2過表達可緩解TAC或異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟氧化應(yīng)激和線粒體結(jié)構(gòu)異常

7. Pak2激活劑JB2019A可緩解急性異丙腎上腺素刺激和慢性TAC誘導(dǎo)的心肌肥厚的促心律失常作用，減少線粒體結(jié)構(gòu)損傷和ROS的產(chǎn)生
為了研究Pak2作為治療心肌肥厚和心律失常的新靶點的可行性，作者開發(fā)了小分子Pak2激活劑JB2019A，其劑量依賴性激活Pak2。通過軟件對接發(fā)現(xiàn)它結(jié)合于Pak2自抑制結(jié)構(gòu)域內(nèi)位點，JB2019A誘導(dǎo)Pak2的變構(gòu)改變，穩(wěn)定其活性形態(tài)，Western blotting證實其能增加磷酸化Pak2表達。在急性腎上腺素能和慢性TAC應(yīng)激條件下，JB2019A激活Pak2的增加減少了心律失常和心臟重構(gòu)。在急性異丙腎上腺素刺激下，能顯著降低Pak2^f/f 小鼠VT發(fā)生率，但對Pak2^cko小鼠影響較小。

圖8. Pak2激活劑JB2019A可減輕TAC誘導(dǎo)的心肌肥厚、降低室性心律失常的易感性

在野生型心臟中，TAC刺激顯著增加室性異位搏動發(fā)生率，JB2019A可使其明顯降低。JB2019A能改善TAC誘導(dǎo)的心肌肥厚，單獨使用時對心肌細胞橫截面積和HW/BW比值無影響。超聲心動圖表明JB2019A可挽救TAC導(dǎo)致的心臟功能障礙。此外，JB2019A處理可減少氧化應(yīng)激，降低ROS水平和線粒體結(jié)構(gòu)變化，抑制TAC誘導(dǎo)的ox-CaMKII增加，對CaMKII信號通路的抑制或能抵御氧化應(yīng)激和線粒體損傷，提供抗心律失常的潛在靶點。

最后，作者檢測了人類心臟組織中Pak2和NOX4的表達，發(fā)現(xiàn)與竇性心律患者相比，接受體外循環(huán)的房顫患者心房附件組織中Pak2表達下降，NOX4表達升高 。

圖9. Pak2激活劑JB2019A可減輕TAC誘導(dǎo)的心臟氧化應(yīng)激和線粒體結(jié)構(gòu)異常

結(jié)論：
綜上，本研究首次揭示了Pak2在心臟應(yīng)激和肥厚相關(guān)室性心律失常中的保護作用。Pak2通過調(diào)控線粒體功能和ROS生成，維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，從而減少心律失常的發(fā)生。Pak2激動劑JB2019A的開發(fā)為未來抗心律失常藥物的研發(fā)提供了新的方向。