總氧自由基清除能力(ORAC)測試試劑操作說明

一、 測定原理

ORAC 法(oxygen radical absorbance capacity，氧自由基吸收能力)是由 Cao 等在 Glazer  研究的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的抗氧化能力的測定方法。它具有生物相關(guān)性強，可以通過改變自由 基和反應(yīng)體系的溶劑測定脂溶性和水溶性物質(zhì)的抗氧化活性，方法的專一性強等優(yōu)點(趙建 等，2011)，因而近年在研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

該方法以偶氮類化合物作為自由基來源，熒光素鈉作為指示劑，水溶性維生素 E（Trolox） 為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行抗氧化分析。氧自由基通過氫原子轉(zhuǎn)移（HAT）過程使熒光探針氧化，并隨 著時間的推移淬滅熒光探針(Huang et al., 2015)。分析中存在的抗氧化劑可阻止熒光探針氧化， 推遲熒光的猝滅，直至樣品中的抗氧化劑活性耗盡。因此可以通過熒光衰減的曲線來計算抗 氧化物質(zhì)的氧自由基清除能力：樣品的氧自由基清除能力越強，熒光素鈉的淬滅越慢，則熒 光強度曲線下面積(AUC)越大。

二、 試劑及耗材組成

稀釋液：100 mL×1 瓶

試劑一：熒光素鈉 100μL ×1 支

試劑二：自由基引發(fā)劑 粉劑 ×1 支

陽性對照：1mM Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液 1mL×1 支（乙醇配制）

黑色熒光酶標(biāo)板 ×1 片

試劑一配制瓶 ×1 個

加樣槽 ×1 個

 

三、 儲存條件及有效期

-20℃可保存 6 個月。

 

四、 試劑的配制

試劑一應(yīng)用液：將試劑一小心轉(zhuǎn)入 10mL 稀釋液中，采用試劑一配制瓶配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

試劑二應(yīng)用液：在試劑二瓶內(nèi)加入 15mL 稀釋液，冰上配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液：首先將 1mM Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液使用稀釋液1按照 1：25 稀釋成 40μM 溶液(最終體系為 200μL，樣品/trolox 添加量為 50μL，因此 40μM trolox 的體系終濃度為 10μM)。

稀釋方法：取 1mM Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液 400μL，加入 9.6mL 稀釋液，充分搖勻，得到終濃 度為 10μM Trolox 溶液 10mL（實際濃度為 40μM）。

按照下表稀釋得到不同濃度的 Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液2：

1 稀釋液一般應(yīng)該與樣品稀釋液保持一致，水溶性樣品可直接采用本試劑盒提供的稀釋液， 脂溶性樣品需自備稀釋液；

2 標(biāo)準(zhǔn)曲線不是必需步驟，但是推薦制作。表中給出的濃度為建議值，您也可以根據(jù)自己樣 品的抗氧化能力適當(dāng)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。

 

五、 操作步驟

直接在黑色熒光酶標(biāo)板按照下表加樣：

充分混勻，37℃避光靜置

 

 

 

充分混勻2，立即采用酶標(biāo)儀進行測定，酶標(biāo)儀設(shè)定參數(shù)如下：

振蕩時間：5s（可選） 

孵育溫度：37℃； 

激發(fā)波長：485±20nm； 

發(fā)射波長：520±20nm； 

讀取方式3：1-5min 讀取 1 次，連續(xù)讀取 60 - 90 min 

 

1迅速加入，建議使用多道移液器快速加入； 

2 如酶標(biāo)儀具備振蕩功能，建議使用酶標(biāo)儀振蕩以節(jié)約時間； 

3 至少反應(yīng) 60min，2min 讀取一次數(shù)據(jù)；也可將讀取時間延長至 90min。

 

六、計算方法

1.計算曲線下面積(AUC) 

將讀取得到的初始熒光值(即開始檢測后第一次讀取的熒光值)記為 F0，第 n 次檢測讀取 得到的熒光值記為 Fn，則采用微積分的思路，AUC 可由如下公式計算： 

AUC = F0/F0 + F1/F0 + F2/F0 + …… + Fn/F0 

2. 計算凈曲線下面積（netAUC） 

如下圖所示，首先如上述計算不加任何抗氧化劑的孔（空白）的 AUC，得到空白 AUC （AUCblank），將樣品（標(biāo)準(zhǔn)品）AUCsample 值減去 AUCblank，即為凈曲線下面積（netAUC）。 

netAUC = AUCsample –AUCblank 

3. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 

將各濃度 Trolox 計算得到的 netAUC 線性擬合成為標(biāo)準(zhǔn)曲線。 

例如：計算得到 netAUC 和標(biāo)準(zhǔn)曲線如下： 

4. 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品等價的 Trolox 當(dāng)量 

如計算得到樣品溶液 netAUC 值為 6.66，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算可知，該樣品溶液與 0.57 μM  TE 的 netAUC 相等，則該樣本溶液 ORAC 值為 0.57 μM TE (Trolox equivalent) . 如已知樣本溶液的濃度為 100 μg/mL，則可進一步計算該樣品的 Trolox 當(dāng)量為 5.7 μmol TE/g。

 

七、注意事項

1. 本試驗需要使用到具有熒光功能的酶標(biāo)儀，建議使用同時具備熒光測定、孵育、振搖和 酶促動力學(xué)讀取功能的酶標(biāo)儀。請在試驗前確定實驗室具備此測定條件，且在試驗前先行了 解測試程序的設(shè)置；

2. 請事先準(zhǔn)備好多道移液器（排槍）；

3. 建議先將樣品梯度稀釋后進行預(yù)試驗，不在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)會造成較大誤差；

4. 試劑二應(yīng)用液建議在加入試劑一應(yīng)用液后的等待時間內(nèi)配制，以盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用。同時， 試劑二請務(wù)必迅速加入，盡可能保證各孔加樣時間一致，以減小系統(tǒng)誤差(Mellado-Ortega et al., 2017)。

5. netAUC 可不計算，只是標(biāo)準(zhǔn)曲線不過原點，但不影響結(jié)果準(zhǔn)確性。本說明書中給出的計 算方法是較為簡單的一種，也可參考相應(yīng)論文中較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)挠嬎愎�式�?/p>

6. ORAC 測試的樣品既可為脂溶性，也可為水溶性。脂溶性樣品處理更為復(fù)雜，因此更推薦采用親水溶劑制備樣品。