自動化多肽合成的新手實用指南及應(yīng)用案例分享

在生物醫(yī)學研究和藥物開發(fā)領(lǐng)域，多肽合成是一項關(guān)鍵技術(shù)。隨著自動化技術(shù)的發(fā)展，多肽合成儀的應(yīng)用越來越廣泛，為科研人員提供了高效、精確的解決方案。

自動化多肽合成的重要性
多肽在藥物研發(fā)、生物醫(yī)學研究等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。例如，在藥物研發(fā)中，多肽類藥物具有高特異性和低毒性的特點，成為治療多種疾病的候選藥物。然而，傳統(tǒng)的手動合成方法不僅耗時耗力，而且容易出錯，難以滿足現(xiàn)代科研的需求。自動化多肽合成儀的出現(xiàn)，大大提高了合成效率和純度，為科研人員提供了更可靠的工具。

自動化多肽合成的基本原理
自動化多肽合成基于固相合成（SPPS）技術(shù)，該技術(shù)由 Bruce Merrifield 于 1963 年發(fā)明。其核心思想是將肽鏈的 C 端固定在固相載體（樹脂）上，通過逐步添加氨基酸來延長肽鏈。每一步反應(yīng)包括脫保護、偶聯(lián)和洗滌，這些步驟可以精確控制和監(jiān)控。

在 SPPS 中，常用的保護基是 Fmoc（9 - 芴甲氧羰基），它可以在溫和的條件下脫除，而側(cè)鏈保護基則在最后一步同時脫除。自動化合成儀通過精確控制試劑的添加和反應(yīng)時間，確保每一步反應(yīng)的高效進行，從而提高產(chǎn)率和純度。
 

• 流體處理系統(tǒng)：確保試劑和溶劑的精確輸送，避免交叉污染�，F(xiàn)代微流體系統(tǒng)如PTI全自動多肽合成儀的 Pure Pathway 采用獨立通道和精確控制技術(shù)，保證了反應(yīng)的一致性。
• 反應(yīng)容器配置：根據(jù)合成規(guī)模和樹脂特性選擇合適的反應(yīng)容器，確保樹脂充分溶脹和試劑有效混合。
• 溫度控制系統(tǒng)：溫度對反應(yīng)速率和副反應(yīng)有顯著影響，精確的溫度控制可以優(yōu)化反應(yīng)條件。
• 實時監(jiān)測功能：通過 UV 監(jiān)測等技術(shù)實時跟蹤反應(yīng)進程，及時調(diào)整脫保護和偶聯(lián)步驟，確保反應(yīng)效率。
• 軟件系統(tǒng)：現(xiàn)代合成軟件不僅控制硬件，還能設(shè)計合成方法、監(jiān)控參數(shù)并記錄數(shù)據(jù)，支持復(fù)雜項目的管理和合規(guī)性要求。

圖 2 PurePpe Chorus全自動多肽合成儀電磁感應(yīng)加熱示意圖
 

圖 3 PurePep Chorus全自動多肽合成儀矩陣式液體傳輸通路示意圖
 

圖 4 PurePep Chorus全自動多肽合成儀軟件實時UV監(jiān)測界面

設(shè)計合成的步驟
設(shè)計一個高效的多肽合成方案需要考慮多個因素，包括起始材料的選擇、脫保護和偶聯(lián)條件的優(yōu)化等。

選擇起始材料

• 樹脂選擇：樹脂是固相合成的基礎(chǔ)，其核心材料（如聚苯乙烯、PEG-PS）和連接子決定了樹脂的溶脹性、疏水性和最終肽鏈的 C 端結(jié)構(gòu)。例如，Rink Amide 樹脂適合合成酰胺化 C 端的肽，而 Wang 樹脂適合合成羧酸 C 端的肽。
• 保護基選擇：Fmoc 保護基用于 α- 氨基的保護，側(cè)鏈保護基則根據(jù)氨基酸的不同選擇合適的基團，如 Pbf 保護精氨酸，tBu 保護絲氨酸等。
• 合成規(guī)模：根據(jù)目標肽的需求確定合成規(guī)模，通常從 20-50μmol 開始，逐步優(yōu)化條件。

優(yōu)化脫保護條件
脫保護是 SPPS 中的關(guān)鍵步驟，直接影響反應(yīng)效率和副反應(yīng)的發(fā)生。常用的脫保護試劑是哌啶（piperidine），但高溫可能導致副反應(yīng)如 Aspartimide 的形成。優(yōu)化脫保護條件包括：

• 溫度控制：對于容易形成 Aspartimide 的序列（如含 Asp 的序列），應(yīng)避免高溫，可選擇室溫或 50°C 進行脫保護。
• 重復(fù)次數(shù)和時間：通過 UV 監(jiān)測確定脫保護的效率，調(diào)整哌啶處理的重復(fù)次數(shù)和時間，確保 Fmoc 完全脫除。

優(yōu)化偶聯(lián)條件
偶聯(lián)反應(yīng)的效率直接影響肽鏈的延伸和最終純度。優(yōu)化策略包括：

• 試劑過量：使用過量的氨基酸（通常 5-7.5 倍當量）和活化劑（如 HCTU、DIC/Oxyma），以推動反應(yīng)向右進行。
• 反應(yīng)時間和溫度：根據(jù)偶聯(lián)化學的不同，調(diào)整反應(yīng)時間和溫度。例如，HCTU/DIPEA 在室溫下需要 15-30 分鐘，而 DIC/Oxyma 在 90°C 下可縮短至 2 分鐘。
• 加熱輔助：對于困難偶聯(lián)，加熱可以加速反應(yīng)，但需注意溫度對序列的影響。

常見問題及解決方法
在自動化多肽合成過程中，可能會遇到一些常見問題，以下是一些解決方法：

• Aspartimide 形成：當肽鏈中含有 Asp 時，重復(fù)的堿性條件（如哌啶處理）可能導致 Aspartimide 的形成，影響純度。解決方法包括降低脫保護溫度、使用弱堿（如添加 HOBt 或甲酸）或更換保護基。
• 樹脂選擇不當：選擇不合適的樹脂可能導致溶脹不足或副反應(yīng)增加。根據(jù)肽鏈的特性（如長度、疏水性）選擇合適的樹脂和連接子。
• 溶劑優(yōu)化：傳統(tǒng)溶劑如 DMF 可能對環(huán)境和健康有影響，研究表明 DMSO 和乳酸乙酯等綠色溶劑在特定條件下可以替代 DMF，減少污染。

優(yōu)化策略

• 使用序列預(yù)測工具：如 Peptide Companion，預(yù)測序列中的困難區(qū)域（如 β- 分支氨基酸、疏水性區(qū)域），提前調(diào)整反應(yīng)條件。
• 實時監(jiān)測和反饋：通過 UV 監(jiān)測實時跟蹤脫保護和偶聯(lián)的效率，自動調(diào)整反應(yīng)時間和重復(fù)次數(shù)。
• 分步優(yōu)化：對于長肽或復(fù)雜序列，分步合成并優(yōu)化每一步的條件，確保整體反應(yīng)的高效進行。
• 組合不同偶聯(lián)化學：根據(jù)不同氨基酸的特性，選擇合適的偶聯(lián)化學，提高反應(yīng)效率。

圖 5 PTI多肽合成儀肽合成預(yù)測軟件界面

案例研究：ACP 肽的合成優(yōu)化
為了更好地理解自動化多肽合成的優(yōu)化過程，我們以 ACP 肽（氨基酸 64-75 片段）為例進行說明。ACP 肽由于其序列中包含 β- 分支氨基酸（纈氨酸、異亮氨酸）和芳香族氨基酸（酪氨酸），被認為是一個具有挑戰(zhàn)性的合成目標。

初始條件

• 樹脂：Rink Amide 樹脂（高負載）
• 脫保護：室溫，2 次，每次 5 分鐘
• 偶聯(lián)：HCTU/DIPEA，7.5 倍當量，2 次，每次 1 分鐘

結(jié)果分析
初始條件下，ACP 肽的粗純度達到 92%，但高負載樹脂的使用導致試劑消耗較大。為了優(yōu)化試劑使用，嘗試將當量降低至 5 倍，同時保持偶聯(lián)時間為 2 次，每次 1 分鐘。結(jié)果粗純度降至 66%，并出現(xiàn)了纈氨酸缺失的情況。

優(yōu)化步驟

• 延長偶聯(lián)時間：將偶聯(lián)時間延長至 2 次，每次 5 分鐘，粗純度提高至 84%，但仍存在纈氨酸缺失。
• 加熱輔助：在偶聯(lián)步驟中引入加熱（如 50°C），進一步提高反應(yīng)效率，粗純度可恢復(fù)至 92%。
• 更換偶聯(lián)化學：使用 DIC/Oxyma 在 90°C 下進行偶聯(lián)，反應(yīng)時間縮短至 1 次，每次 2 分鐘，粗純度仍保持在 92%。

圖 6 利用PurePep Chorus全自動多肽合成儀合成ACP粗肽結(jié)果

經(jīng)驗總結(jié)
通過調(diào)整試劑當量、反應(yīng)時間和溫度，以及選擇合適的偶聯(lián)化學，可以在保證粗純度的同時優(yōu)化試劑消耗和反應(yīng)時間。對于困難序列，加熱輔助和分步優(yōu)化是有效的策略。

自動化多肽合成的未來趨勢
隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，自動化多肽合成領(lǐng)域也在不斷創(chuàng)新。以下是一些未來的發(fā)展趨勢：

• 綠色化學：開發(fā)更環(huán)保的溶劑和試劑，減少對環(huán)境的影響。例如，使用 DMSO 和乳酸乙酯替代 DMF。
• 智能化系統(tǒng)：通過人工智能和機器學習優(yōu)化反應(yīng)條件，預(yù)測合成結(jié)果，提高合成效率。
• 高通量合成：實現(xiàn)同時合成多個不同的肽，滿足大規(guī)模篩選的需求。
• 新型樹脂和連接子：開發(fā)更高效、更具選擇性的樹脂和連接子，拓寬合成范圍。

總結(jié)
自動化多肽合成儀為科研人員提供了高效、精確的解決方案，從基礎(chǔ)原理到優(yōu)化策略，都需要深入理解和實踐。通過合理選擇起始材料、優(yōu)化反應(yīng)條件和實時監(jiān)測，可以顯著提高多肽合成的產(chǎn)率和純度。未來，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，自動化多肽合成將在更多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，推動生物醫(yī)學研究和藥物開發(fā)的進步。

PurePep Chorus全自動多通道平行多肽合成儀

• 唯一的三位一體系統(tǒng)（合成、切割、純化）
• 可配置2、4或6個反應(yīng)容器
• 選配可控感應(yīng)加熱和振蕩混勻
• 選配實時紫外線監(jiān)測
• 內(nèi)置PurePep Pathway流路系
• Single Shot^TM液體傳輸技術(shù)
• 直觀的操作軟件
• 自動原位切肽
• 自動多肽純化