多模態(tài)超分辨顯微技術(shù)的突破與應(yīng)用

熒光標(biāo)記的超分辨顯微成像技術(shù)，以其高分辨率、特異性強(qiáng)、可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察等優(yōu)點(diǎn)，成為了探索生物醫(yī)學(xué)現(xiàn)象和作用機(jī)制的重要工具。然而，固定、染色等處理過(guò)程不僅繁瑣，還可能對(duì)樣品的生物結(jié)構(gòu)與活性產(chǎn)生干擾。與此同時(shí)，無(wú)標(biāo)記顯微成像技術(shù)因能避免這些處理，也逐漸受到關(guān)注。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
在細(xì)胞生物學(xué)研究中，成像技術(shù)一直是不可或缺的工具。傳統(tǒng)的寬場(chǎng)熒光顯微鏡受到光學(xué)衍射極限的限制，無(wú)法滿足研究者對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察的需求。20世紀(jì)末至21世紀(jì)初，多種超分辨顯微成像技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，其中結(jié)構(gòu)光照明超分辨顯微技術(shù)（SIM）因其較低的光漂白性和光毒性、較高的成像速度，成為主流的超分辨顯微成像技術(shù)之一，尤其適合活細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間成像。然而，固定和染色等處理過(guò)程不僅繁瑣，還可能對(duì)樣品的生物結(jié)構(gòu)與活性造成干擾，并且存在光漂白和光毒性等問題。

而在無(wú)需熒光染料的情況下對(duì)樣品進(jìn)行觀察的無(wú)標(biāo)記顯微成像技術(shù)，雖然其分辨率通常低于超分辨熒光顯微技術(shù)，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)特定結(jié)構(gòu)的可視化，但無(wú)侵入性、簡(jiǎn)單便捷、能夠進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間活體實(shí)驗(yàn)是其主要優(yōu)勢(shì)，因此一些無(wú)標(biāo)記顯微成像技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床診斷和分子醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。隨著生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究需求日益多樣化，單一成像模式已難以滿足科研人員的需求，成像模式的擴(kuò)展變得尤為重要，因此結(jié)合多種成像模態(tài)的顯微成像系統(tǒng)的研究意義重大。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
SIM與ROCS的原理與結(jié)合
結(jié)構(gòu)光照明超分辨顯微技術(shù)（SIM）的原理是通過(guò)余弦形式的結(jié)構(gòu)光照明將樣品的高頻信息編碼至低頻區(qū)域，采集原始圖像后對(duì)高頻分量進(jìn)行分離和拼接，通過(guò)拓展圖像頻譜實(shí)現(xiàn)超分辨成像。旋轉(zhuǎn)相干散射顯微成像技術(shù)（ROCS）則是通過(guò)使用相位型空間光調(diào)制器（SLM）產(chǎn)生多個(gè)方向的斜照明光束照射樣品，以照明光束完成360°的掃描為一個(gè)照明周期，在一個(gè)照明周期內(nèi)相機(jī)保持持續(xù)曝光收集樣品散射光，從而實(shí)現(xiàn)高分辨和高對(duì)比度的相干光無(wú)標(biāo)記成像。結(jié)合SIM和ROCS這兩種不同類型的成像方法，搭建了SIM-ROCS雙模態(tài)顯微成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以在兩種模式之間進(jìn)行任意切換，既具備超分辨熒光顯微成像功能，又具備高分辨率無(wú)標(biāo)記成像功能，為細(xì)胞生物學(xué)的研究提供了新的工具。

系統(tǒng)搭建與硬件設(shè)計(jì)
所搭建的SIM-ROCS雙模態(tài)顯微成像系統(tǒng)主要由照明光路、熒光探測(cè)路和散射探測(cè)路三部分組成。照明光路中，激光器發(fā)出的線偏光經(jīng)過(guò)一系列光學(xué)元件的處理后，通過(guò)空間濾波器（mask）進(jìn)行空間濾波，根據(jù)成像模式的不同需求設(shè)計(jì)不同的mask，實(shí)現(xiàn)不同的空間濾波功能。在熒光探測(cè)路中，經(jīng)物鏡聚焦的結(jié)構(gòu)光照射在樣品上，激發(fā)熒光信號(hào)，依次通過(guò)物鏡、二向色鏡、發(fā)射濾光片等元件后在相機(jī)的靶面成像。而散射探測(cè)路則用于無(wú)標(biāo)記ROCS成像，經(jīng)物鏡聚焦的激光照射在樣品上激發(fā)散射光，依次通過(guò)物鏡、二向色鏡、光闌等元件后在相機(jī)的靶面成像。此外，系統(tǒng)中各模式涉及的不同器件之間的時(shí)序同步和觸發(fā)設(shè)計(jì)也是關(guān)鍵，通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)可編程門陣列（FPGA）進(jìn)行整體觸發(fā)控制，使系統(tǒng)達(dá)到微秒級(jí)精度的時(shí)序同步與控制，確保整個(gè)系統(tǒng)高效、正確地采集所需的圖像。

成像實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析
熒光微球標(biāo)準(zhǔn)樣品成像分析
通過(guò)使用100nm的熒光微球標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)SIM-ROCS雙模態(tài)顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試，在SIM和ROCS通道分別得到了111nm和145nm的空間分辨率。通過(guò)對(duì)單個(gè)微球圖像沿中心的強(qiáng)度展開進(jìn)行高斯擬合求取其半峰全寬（FWHM），得到SIM通道的空間分辨率為111.4nm，寬場(chǎng)熒光通道的分辨率為254.6nm，ROCS通道的高斯擬合后的FWHM為290.9nm。同時(shí)，通過(guò)瑞利判據(jù)和圖像頻譜寬度的倒數(shù)測(cè)量，ROCS系統(tǒng)的分辨率為145nm。

在同一視野下對(duì)200nm的熒光微球樣品分別進(jìn)行普通寬場(chǎng)熒光成像、SIM超分辨成像和ROCS散射成像，并對(duì)感興趣的區(qū)域放大，結(jié)果顯示在普通寬場(chǎng)圖像中無(wú)法分辨的兩個(gè)熒光微球，在ROCS圖像中得以區(qū)分，說(shuō)明ROCS成像模式有效提高了圖像的分辨率。此外，對(duì)于可分辨的微球，ROCS模式下的強(qiáng)度分布有兩個(gè)非常明確的峰值，可以對(duì)兩個(gè)微球進(jìn)行分辨，且ROCS圖像中兩點(diǎn)之間的距離比實(shí)際距離略寬，與理論相符。同時(shí)，ROCS模式在提高鄰近物體之間的對(duì)比度方面也表現(xiàn)出色，峰值與谷值之間相差更大，有利于對(duì)圖像進(jìn)行分析和處理。

PANC-1胰腺癌細(xì)胞樣品成像分析
對(duì)PANC-1胰腺癌細(xì)胞樣品，使用熒光探針對(duì)其進(jìn)行染色，并在ROCS和寬場(chǎng)熒光模式下對(duì)該樣品進(jìn)行成像。結(jié)果顯示，寬場(chǎng)熒光和ROCS圖像視野內(nèi)的PANC-1細(xì)胞尖端有著較為清晰的偽足結(jié)構(gòu)，并且對(duì)于細(xì)胞邊界和偽足，ROCS圖像的對(duì)比度高于寬場(chǎng)熒光圖像。沿偽足部分做強(qiáng)度分布的展開，ROCS圖像對(duì)于偽足這一結(jié)構(gòu)的分辨率、對(duì)比度和信噪比均優(yōu)于寬場(chǎng)熒光圖像，邊界清晰明顯，更有利于對(duì)樣品進(jìn)行觀察和分析。

此外，作為相干光無(wú)標(biāo)記成像方法，ROCS在獲得較高信噪比時(shí)所需的光劑量與熒光通道相比非常微小，光毒性更低。對(duì)PANC-1胰腺癌細(xì)胞的成像結(jié)果體現(xiàn)了ROCS對(duì)于偽足結(jié)構(gòu)的成像優(yōu)勢(shì)，以及它在成像過(guò)程中所需光功率極小、光毒性遠(yuǎn)低于熒光成像的特點(diǎn)。

總結(jié)與展望
根據(jù)SIM和ROCS兩種成像方法在原理和系統(tǒng)上的異同點(diǎn)設(shè)計(jì)并搭建了SIM-ROCS雙模態(tài)成像系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了超分辨熒光和無(wú)標(biāo)記成像功能的集合。通過(guò)對(duì)熒光微球標(biāo)準(zhǔn)樣品和PANC-1胰腺癌細(xì)胞樣品在不同通道下的成像結(jié)果進(jìn)行分析，驗(yàn)證了該系統(tǒng)的可行性和有效性。該系統(tǒng)在對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品成像的實(shí)驗(yàn)中性能表現(xiàn)良好，但在對(duì)生物樣品的成像實(shí)驗(yàn)中由于樣品和器件的限制，在熒光通道出現(xiàn)了信噪比偏低的現(xiàn)象，沒有取得理想的成像結(jié)果。在將來(lái)的工作中，可以通過(guò)對(duì)樣品和熒光染料的對(duì)比選擇以及對(duì)分光器件和探測(cè)方案的優(yōu)化，在保證ROCS通道成像質(zhì)量的前提下進(jìn)一步提高熒光通道的性能。此外，還可以開展由ROCS到SIM跨模態(tài)圖像翻譯的相關(guān)工作，探索更多成像技術(shù)的融合與創(chuàng)新，為細(xì)胞生物學(xué)的研究提供更加強(qiáng)大的成像工具，助力生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究取得更多的突破和進(jìn)展。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來(lái)源于：孫瑋, 劉更亮, 文剛, 陳曉虎, 梁永, 李輝. 結(jié)構(gòu)光照明超分辨熒光與旋轉(zhuǎn)相干散射雙模態(tài)成像[J]. 激光與光電子學(xué)進(jìn)展, 2024, 61(20): 2011022. 

doi:10.3788/LOP241204.