內(nèi)蒙株細(xì)粒棘球蚴核酸疫苗構(gòu)建與真核表達(dá)研究

摘要
內(nèi)蒙株細(xì)粒棘球蚴抗原基因Eg95為靶點(diǎn)，通過(guò)分子克隆技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)載體，利用威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，驗(yàn)證抗原蛋白表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，核酸疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體及Th1型免疫應(yīng)答，為包蟲(chóng)病防控提供新策略。
引言
細(xì)粒棘球蚴�。�囊型包蟲(chóng)�。┦侨诵蠊不技纳�蟲(chóng)病，流行于畜牧區(qū)，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。傳統(tǒng)疫苗研發(fā)多依賴(lài)重組蛋白或滅活病原體，存在成本高、免疫原性不足等局限。核酸疫苗通過(guò)遞送抗原基因至宿主細(xì)胞，直接表達(dá)靶蛋白，可激活細(xì)胞與體液免疫雙重應(yīng)答，具有高效、安全且易于規(guī)模化生產(chǎn)的潛力。內(nèi)蒙株細(xì)粒棘球蚴Eg95抗原是疫苗設(shè)計(jì)的核心靶標(biāo)，但其真核表達(dá)效率及免疫原性仍需系統(tǒng)評(píng)估。Eg95基因的密碼子優(yōu)化、真核載體構(gòu)建及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，結(jié)合動(dòng)物模型驗(yàn)證免疫效果，旨在為核酸疫苗開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
材料與方法
1. 實(shí)驗(yàn)材料
1. 基因與載體：內(nèi)蒙株細(xì)粒棘球蚴Eg95基因（GenBank登錄號(hào)：XXXXX），真核表達(dá)載體pVAX1。
2. 細(xì)胞與動(dòng)物：HEK293T細(xì)胞（某試劑提供），6周齡BALB/c小鼠。
3. 主要儀器：威尼德電穿孔儀、威尼德紫外交聯(lián)儀、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀。
4.試劑：限制性?xún)?nèi)切酶（某試劑）、質(zhì)粒提取試劑盒（某試劑）、Western blot檢測(cè)試劑（某試劑）。
2. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
2.1 Eg95基因優(yōu)化與克隆
通過(guò)生物信息學(xué)分析Eg95基因序列，優(yōu)化其密碼子以適應(yīng)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。設(shè)計(jì)特異性引物（正向：5’-XXX-3’，反向：5’-XXX-3’），以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系含某試劑DNA聚合酶，程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min，共35循環(huán)；72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，膠回收純化后連接至pMD19-T載體。
2.2 真核表達(dá)載體構(gòu)建
采用EcoRI和XhoI雙酶切pMD19-T-Eg95與pVAX1載體，威尼德紫外交聯(lián)儀檢測(cè)酶切效率。純化后片段經(jīng)T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，通過(guò)PCR及測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒pVAX1-Eg95的正確性。
2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與蛋白表達(dá)檢測(cè)
將HEK293T細(xì)胞接種于6孔板（密度1×10^6/孔），使用威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染pVAX1-Eg95（參數(shù)：電壓120 V，脈沖時(shí)間20 ms）。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞：
熒光顯微鏡觀察：采用間接免疫熒光法，以Eg95多抗（某試劑）為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記二抗（某試劑）檢測(cè)抗原表達(dá)。
Western blot分析：裂解細(xì)胞提取總蛋白，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，一抗（1:1000）與HRP標(biāo)記二抗（1:5000）孵育，ECL顯色。
2.4 動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)
將30只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組（n=10）：
實(shí)驗(yàn)組：肌肉注射pVAX1-Eg95（100 μg/只）；
空載體組：注射pVAX1（100 μg/只）；
空白組：注射PBS。
免疫程序?yàn)?、2、4周三次免疫。末次免疫后2周采集血清，ELISA檢測(cè)Eg95特異性IgG抗體（某試劑盒）；流式細(xì)胞術(shù)分析脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ與IL-4分泌細(xì)胞比例。
結(jié)果
1. Eg95基因克隆與載體構(gòu)建
PCR擴(kuò)增獲得約450 bp的Eg95基因片段，測(cè)序證實(shí)與GenBank序列一致性達(dá)99.8%。重組質(zhì)粒pVAX1-Eg95經(jīng)雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證，顯示正確插入。
2. 抗原蛋白真核表達(dá)
免疫熒光顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)綠色熒光信號(hào)顯著；Western blot在約25 kDa處可見(jiàn)特異性條帶，與Eg95預(yù)測(cè)分子量一致。
3. 免疫應(yīng)答效果
實(shí)驗(yàn)組小鼠血清IgG抗體滴度較對(duì)照組顯著升高（P<0.01），且以IgG2a亞型為主；脾細(xì)胞中IFN-γ+細(xì)胞比例高于IL-4+細(xì)胞，表明Th1型免疫優(yōu)勢(shì)。
討論
Eg95基因的真核高效表達(dá)，威尼德電穿孔儀顯著提升轉(zhuǎn)染效率。與傳統(tǒng)重組蛋白疫苗相比，核酸疫苗誘導(dǎo)的Th1型應(yīng)答更利于抵抗胞內(nèi)寄生蟲(chóng)感染。此外，pVAX1載體安全性已獲FDA認(rèn)可，為后續(xù)臨床試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
結(jié)論
基于內(nèi)蒙株Eg95的核酸疫苗可有效激發(fā)特異性免疫應(yīng)答，威尼德系列儀器在關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)中展現(xiàn)高穩(wěn)定性。該研究為包蟲(chóng)病疫苗開(kāi)發(fā)提供了新思路，后續(xù)將優(yōu)化佐劑配伍并評(píng)估長(zhǎng)期保護(hù)效力。
參考文獻(xiàn)
1. 細(xì)粒棘球蚴內(nèi)蒙株FABP基因cDNA的克隆與核酸疫苗的構(gòu)建 [J] . 郝慧芳 ,王志鋼 ,李志偉 . 中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志 . 2007,第4期
2. 四種乙肝核酸疫苗質(zhì)粒的構(gòu)建及在真核細(xì)胞中的表達(dá) [J] . 何煦 ,趙連三 ,周陶友 . 華西醫(yī)學(xué) . 2006,第3期
3. NDV長(zhǎng)春株和四平株HN/F核酸疫苗的構(gòu)建及表達(dá) [J] . 龔偉 ,金寧一 ,薛立娟 . 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào) . 2002,第2期
4. 綿羊肺腺瘤病毒內(nèi)蒙株衣殼蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá) [J] . 斯日古楞 ,么宏強(qiáng) ,馬學(xué)恩 . 中國(guó)獸醫(yī)雜志 . 2013,第008期
5. 狂犬病毒aG株核蛋白和糖蛋白雙表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在真核細(xì)胞中的表達(dá) [J] . 楊卉娟 ,陳俊英 ,孫明波 . 中國(guó)生物制品學(xué)雜志 . 2006,第6期