組織透明3D成像可視化胚胎與胎盤發(fā)育的技術(shù)創(chuàng)新及應(yīng)用

在生命科學(xué)領(lǐng)域，對器官三維結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)解析一直是探索生理與病理機(jī)制的核心目標(biāo)。傳統(tǒng)組織學(xué)方法依賴二維切片重建，難以完整保留器官結(jié)構(gòu)且易受操作變形影響。而新興的組織透明化技術(shù)結(jié)合光片顯微鏡，為解決這一難題提供了全新路徑。2017年發(fā)表于《Scientific Reports》的一項(xiàng)研究，通過改良的CUBIC組織透明化方法，成功實(shí)現(xiàn)了小鼠子宮內(nèi)胚胎與胎盤的三維可視化，為深入理解胎盤發(fā)育及相關(guān)疾病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
傳統(tǒng)組織學(xué)方法的局限性
在該研究之前，科研人員主要依靠傳統(tǒng)的組織切片和染色技術(shù)來分析子宮和胎盤的結(jié)構(gòu)。這些方法需要制備大量連續(xù)的薄組織切片，然后通過染色來觀察細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)。然而，這種方法存在明顯的局限性。首先，在切片過程中，組織很容易發(fā)生變形。其次，染色過程也可能破壞組織的完整性。染色劑可能無法均勻地滲透到組織的各個(gè)部分，導(dǎo)致某些區(qū)域的染色效果不佳，影響對細(xì)節(jié)的觀察。此外，通過二維切片來重建三維結(jié)構(gòu)是一項(xiàng)非常復(fù)雜且耗時(shí)的工作。因此，傳統(tǒng)方法在分析子宮和胎盤的三維結(jié)構(gòu)時(shí)面臨著巨大的挑戰(zhàn)。

子宮與胎盤的結(jié)構(gòu)特殊性
子宮和胎盤的結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的特殊性，這使得傳統(tǒng)的成像方法難以有效應(yīng)用。子宮是一個(gè)肌肉豐富的器官，其肌肉組織的存在會(huì)對光線的穿透造成阻礙。而胎盤則是一個(gè)血管密集的器官，富含血液和血管，這使得光線在穿透胎盤時(shí)會(huì)被大量吸收和散射，導(dǎo)致成像效果不佳。具體來說，子宮的肌肉組織中含有大量的肌紅蛋白，而胎盤的血管中含有大量的血紅蛋白。這些色素分子會(huì)吸收特定波長的光線，使得傳統(tǒng)的光學(xué)成像技術(shù)難以穿透這些組織，從而無法獲取清晰的內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖像。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
CUBIC方法的改良與優(yōu)勢
在這項(xiàng)研究中，科研人員選擇了CUBIC方法，并對其進(jìn)行了改良，以適應(yīng)子宮和胎盤的特殊結(jié)構(gòu)。CUBIC方法的核心在于其獨(dú)特的試劑配方，能夠有效地去除組織中的色素分子，如血紅蛋白和肌紅蛋白，同時(shí)保持組織的完整性和熒光標(biāo)記的穩(wěn)定性。

CUBIC試劑由多種成分組成，這些成分相互作用，能夠溶解和去除組織中的脂類和色素，同時(shí)保持組織的三維結(jié)構(gòu)。與其他組織透明化方法相比，CUBIC方法具有明顯的優(yōu)勢。首先，它能夠高效地去除子宮和胎盤中的血紅蛋白和肌紅蛋白，使組織變得透明，從而允許光線穿透，進(jìn)行三維成像。其次，CUBIC方法對組織的損傷較小，能夠較好地保持組織的結(jié)構(gòu)和抗原性，為后續(xù)的免疫組織化學(xué)染色等分析提供了可能。此外，CUBIC方法的處理時(shí)間相對較短，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)完成組織透明化處理，提高了實(shí)驗(yàn)效率。

光片顯微鏡的優(yōu)勢在于其能夠在較短的時(shí)間內(nèi)獲取高分辨率的三維圖像，同時(shí)對樣本的損傷較小。這使得它非常適合用于對活體樣本或脆弱的組織樣本進(jìn)行成像。在這項(xiàng)研究中，光片顯微鏡被用于對透明化的子宮和胎盤進(jìn)行成像，成功獲取了胚胎和胎盤的三維結(jié)構(gòu)圖像，為后續(xù)的分析提供了高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。

成像實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析
實(shí)驗(yàn)流程與關(guān)鍵步驟
樣本制備：實(shí)驗(yàn)選用了不同孕期的小鼠子宮和胎盤作為研究對象。首先，對小鼠進(jìn)行深度麻醉，然后通過心臟灌注4%多聚甲醛（PFA）/磷酸鹽緩沖液（PBS）和碘化丙啶（PI）溶液，對組織進(jìn)行固定和染色。固定完成后，將子宮和胎盤組織分離出來，進(jìn)一步在4%PFA中浸泡過夜，以確保組織充分固定。

CUBIC透明化處理：將固定好的組織浸泡在CUBIC-1試劑中，在37°C下溫和振蕩處理3天。之后更換新鮮的CUBIC-1試劑，繼續(xù)處理2天。這一步驟的目的是去除組織中的脂類和色素，使組織變得透明。處理完成后，用PBS對組織進(jìn)行3次清洗，每次清洗在室溫下溫和振蕩進(jìn)行。接著，將組織浸泡在20%蔗糖的PBS溶液中1天，進(jìn)行脫水處理。最后，將組織浸泡在CUBIC-2試劑中2天，進(jìn)一步優(yōu)化組織的透明度和折射率。

光片顯微鏡成像：將透明化處理后的組織樣本置于光片顯微鏡下進(jìn)行成像。使用物鏡獲取整個(gè)生殖器官的整體圖像、具有單細(xì)胞分辨率的詳細(xì)圖像。在成像過程中，使用638nm的激發(fā)波長來激發(fā)組織中的自發(fā)熒光信號，同時(shí)結(jié)合PI和EGFP的熒光標(biāo)記，獲取高質(zhì)量的三維圖像。

圖像分析與處理：使用ZEN軟件對獲取的三維圖像進(jìn)行分析和處理。通過三維重建和圖像處理技術(shù)，科研人員能夠從不同角度觀察子宮和胎盤的結(jié)構(gòu)，獲取各種截面圖像，并進(jìn)行定量分析。

細(xì)胞核與特定細(xì)胞的定位：利用PI染色，科研人員成功標(biāo)記了子宮和胎盤中的細(xì)胞核。通過三維成像，可以清晰地看到細(xì)胞核在組織中的分布情況，以及細(xì)胞的排列方式。此外，結(jié)合EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠，科研人員能夠特異性地標(biāo)記胚胎和胎盤的特定細(xì)胞，如滋養(yǎng)層細(xì)胞。通過觀察EGFP標(biāo)記的細(xì)胞，科研人員能夠追蹤這些細(xì)胞在子宮內(nèi)的遷移路徑，以及它們與母體組織的相互作用。

免疫組織化學(xué)驗(yàn)證：為了驗(yàn)證成像結(jié)果的準(zhǔn)確性，科研人員對透明化的組織樣本進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。他們選擇了血管內(nèi)皮標(biāo)記物CD31和滋養(yǎng)層標(biāo)記物細(xì)胞角蛋白-7（CK7）進(jìn)行染色。在染色后的組織切片中，能夠清晰地觀察到CD31和CK7的陽性信號，這表明CUBIC透明化處理并沒有破壞組織的抗原性，為后續(xù)的免疫組織化學(xué)分析提供了可能。

總結(jié)與展望
通過改良CUBIC組織透明化技術(shù)與光片顯微鏡結(jié)合，首次實(shí)現(xiàn)了小鼠子宮內(nèi)胚胎與胎盤的三維可視化，突破了傳統(tǒng)組織學(xué)方法的局限。研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的CUBIC方案能有效消除子宮肌紅蛋白和胎盤血紅蛋白的干擾，保留組織完整性，并通過PI染色和EGFP轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞核與特定細(xì)胞的精準(zhǔn)定位。光片顯微鏡的應(yīng)用進(jìn)一步提供了單細(xì)胞分辨率的三維成像能力，揭示了胚胎與胎盤在子宮內(nèi)的空間分布及動(dòng)態(tài)發(fā)育過程，為胎盤血管重塑、滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲等關(guān)鍵機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

然而，PI在胚胎深部的染色效率不足，晚期胎盤組織的成像分辨率有待提升，且人類樣本的適用性尚未驗(yàn)證。未來研究可聚焦于技術(shù)優(yōu)化，開發(fā)更高效的染色策略（如原位雜交或新型熒光探針），提升深層組織標(biāo)記效果，探索CUBIC與超分辨顯微鏡的結(jié)合，突破光學(xué)衍射極限。

Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M. et al. Three-dimensional visualization of intrauterine conceptus through the uterine wall by tissue clearing method. Sci Rep 7, 5964 (2017).

DOI:10.1038/s41598-017-06549-6.