激光共聚焦顯微鏡助力腫瘤抑制劑研究

 
01 文章內(nèi)容 

文章聚焦于鐵死亡抑制蛋白FSP1（ferroptosis suppressor protein-1）的研究。研究人員通過篩選小分子庫發(fā)現(xiàn)icFSP1這一新型 FSP1 抑制劑，它能誘導(dǎo)鐵死亡，且作用機(jī)制不同于以往的iFSP1，不直接抑制FSP1酶活性，而是使FSP1發(fā)生亞細(xì)胞重定位并凝聚，進(jìn)而促進(jìn)FSP1相分離，引發(fā)脂質(zhì)過氧化和鐵死亡。這一過程依賴FSP1的N端肉豆蔻酰化、特定氨基酸殘基及相關(guān)結(jié)構(gòu)區(qū)域。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示icFSP1能抑制腫瘤生長，通過誘導(dǎo)FSP1從膜上解離和相分離形成凝聚物，引發(fā)脂質(zhì)過氧化和鐵死亡。文章中利用激光共聚焦顯微鏡為探究icFSP1誘導(dǎo)鐵死亡機(jī)制提供關(guān)鍵依據(jù)：

1.icFSP1對(duì)hFSP1亞細(xì)胞定位的影響：

展示了對(duì)穩(wěn)定過表達(dá)FSP1–EGFP–Strep的野生型細(xì)胞用2.5μM的icFSP1處理后立即采集的代表性時(shí)間推移熒光圖像1（下圖c）。結(jié)果顯示，icFSP1處理后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯焦點(diǎn)和凝聚物，而iFSP1處理組無此現(xiàn)象，表明icFSP1顯著改變hFSP1亞細(xì)胞定位，此變化先于脂質(zhì)過氧化和鐵死亡。

 
2.FSP1凝聚物形成過程及特性：

對(duì)穩(wěn)定過表達(dá)hFSP1-EGFP-Strep的Pfa1細(xì)胞用 icFSP1處理，在不同時(shí)間點(diǎn)拍攝熒光圖像2（下圖d），觀察到凝聚物數(shù)量隨時(shí)間增加，體現(xiàn)其形成的時(shí)間依賴性。用鐵死亡標(biāo)記物（Liperfluo）與碘化丙啶（PI）對(duì)穩(wěn)定過表達(dá)hFSP1-BFP的細(xì)胞進(jìn)行共染色處理，標(biāo)記脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞死亡情況（下圖e）。碘化丙啶具有特殊的染色特性，只有當(dāng)細(xì)胞膜出現(xiàn)破損，其才能進(jìn)入細(xì)胞并對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。使用icFSP1處理表達(dá)hFSP1-BFP的細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)迅速誘導(dǎo)產(chǎn)生凝聚物。緊接著，Liperfluo發(fā)生氧化，這意味著細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)開始啟動(dòng)。此后，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物信號(hào)持續(xù)增強(qiáng)，直至細(xì)胞對(duì)碘化丙啶染色呈現(xiàn)陽性，這一現(xiàn)象表明細(xì)胞膜已破裂，細(xì)胞走向死亡。從整個(gè)過程可以清晰地看到，F(xiàn)SP1亞細(xì)胞定位的改變發(fā)生在脂質(zhì)過氧化和鐵死亡之前，這一結(jié)果為深入理解鐵死亡的發(fā)生機(jī)制提供了重要線索。

> Tip1,2：
中心（公司）超高分辨率激光共聚焦顯微鏡平臺(tái)，提供配套細(xì)胞培養(yǎng)箱，可以供即時(shí)或不同時(shí)間點(diǎn)采集圖像的實(shí)驗(yàn)，可確保實(shí)驗(yàn)的時(shí)效性。

3.FSP1凝聚物的動(dòng)態(tài)變化及相分離特性：

觀察穩(wěn)定過表達(dá)hFSP1-EGFP-Strep的Pfa1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)icFSP1處理后凝聚物動(dòng)態(tài)自由移動(dòng)并融合（下圖a），洗脫抑制劑后凝聚物變化可逆（下圖b）。進(jìn)行熒光漂白恢復(fù)（FRAP）分析3（下圖 c、d），發(fā)現(xiàn)早期凝聚物有FRAP現(xiàn)象，晚期無，結(jié)合其類似液滴的特性，表明hFSP1凝聚物可能涉及相分離。

> Tip3：
中心（公司）超高分辨率激光共聚焦顯微鏡平臺(tái)配備有熒光漂白恢復(fù)（FRAP）功能，可進(jìn)行樣本定點(diǎn)光照射，并提供光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（時(shí)長、圖像等）。

4.FSP1凝聚物與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的關(guān)系：

對(duì)穩(wěn)定過表達(dá)hFSP1-EGFP-Strep的細(xì)胞用icFSP1處理后，與多種細(xì)胞器特異性標(biāo)記物共染4（下圖b），結(jié)果顯示hFSP1凝聚物不與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、脂質(zhì)滴、內(nèi)體、溶酶體等細(xì)胞器共定位，表明其并非定位于特定細(xì)胞器。

> Tip4：
中心（公司）超高分辨率激光共聚焦顯微鏡平臺(tái)可進(jìn)行多通道（410-850nm）同時(shí)成像，同時(shí)提供單通道和多通道合并數(shù)據(jù)，多通道樣本可根據(jù)客戶要求提供個(gè)性化通道合并數(shù)據(jù)。

5.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中FSP1凝聚物檢測(cè)：

對(duì)腫瘤組織進(jìn)行免疫熒光染色，用抗HA（hFSP1）抗體標(biāo)記（下圖g、h），在icFSP1處理的腫瘤組織中，觀察到hFSP1凝聚物信號(hào)增強(qiáng)，表明icFSP1在體內(nèi)可誘導(dǎo)FSP1相分離，促進(jìn)脂質(zhì)過氧化。對(duì)過表達(dá)不同F(xiàn)SP1突變體的腫瘤組織染色（下圖h），發(fā)現(xiàn)Q319K突變體在icFSP1處理后無凝聚物，細(xì)胞對(duì)icFSP1耐藥，驗(yàn)證特定氨基酸殘基在FSP1相分離和藥物敏感性中的重要性。

 
02 文章總結(jié) 

該研究揭示了icFSP1獨(dú)特的作用機(jī)制，即通過誘導(dǎo)FSP1從膜上解離和相分離形成凝聚物，引發(fā)脂質(zhì)過氧化和鐵死亡。這為理解FSP1的調(diào)控機(jī)制提供了新視角，也為開發(fā)新型抗癌療法提供了潛在的藥物靶點(diǎn)和理論依據(jù)，未來應(yīng)進(jìn)一步開發(fā)同時(shí)靶向cyst(e)ine–GSH–GPX4節(jié)點(diǎn)和FSP1系統(tǒng)的藥物，以更有觸發(fā)腫瘤細(xì)胞鐵死亡，為攻克癌癥這一醫(yī)學(xué)難題帶來新的曙光。

03 平臺(tái)介紹 

中心（公司）超高分辨率激光共聚焦顯微鏡平臺(tái)搭建的Leica Stellaris 5超高分辨率激光共聚焦系統(tǒng)，具有22mm均勻大視場(chǎng)及8K超高清掃描分辨率兩大優(yōu)勢(shì)，同時(shí)搭載Power HyD檢測(cè)器，可實(shí)現(xiàn)更高的光子探測(cè)效率。整合的多層智能模塊體系，包含精準(zhǔn)自聚焦、全景拼圖、多維時(shí)序成像以及光譜解碼等功能組件，尤其配備專業(yè)級(jí)共定位分析與智能三維重構(gòu)系統(tǒng)，通過模組化擴(kuò)展設(shè)計(jì)持續(xù)賦能生命科學(xué)探索新邊界。