凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢測的驗(yàn)證策略與BET計算公式解讀

凝膠檢測作為經(jīng)典的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法，自20世紀(jì)70年代起便在醫(yī)藥領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。1980年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）率先制定相關(guān)指導(dǎo)原則，隨后美國藥典（USP）也將其納入標(biāo)準(zhǔn)，使其成為法定檢測方法。

USP<85>明確規(guī)定：“當(dāng)測定結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠限度法結(jié)果為準(zhǔn)”，確立了凝膠檢測在細(xì)菌內(nèi)毒素檢測中的重要地位。
 

一、凝膠檢測方法操作概述
在實(shí)際操作中，首先要制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)系列，所需材料包括內(nèi)毒素控制標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）、無熱原水（LRW）和LAL試劑。LAL試劑的靈敏度（λ）是關(guān)鍵參數(shù)，通常標(biāo)注在分析證書（CoA）和試劑小瓶上。測試標(biāo)準(zhǔn)曲線的稀釋倍數(shù)一般設(shè)為2λ、λ、0.5λ和0.25λ，且標(biāo)準(zhǔn)曲線只有在λ的2倍稀釋范圍內(nèi)呈現(xiàn)陽性結(jié)果才有效。

具體測試時，將100µL的產(chǎn)品稀釋液與100µL的LAL試劑等量混合。陽性產(chǎn)品對照需通過將產(chǎn)品稀釋后接種至2λ內(nèi)毒素水平來制備，同時要設(shè)置未接種稀釋液（如LRW）作為陰性對照。

混合后的試管在37°C環(huán)境下孵育60分鐘±2分鐘。孵育結(jié)束后，輕輕取出試管并緩緩倒轉(zhuǎn)180°，觀察凝膠形成情況。若管內(nèi)形成堅實(shí)凝膠，且不變形、不從管壁滑脫，則判定為陽性；反之則為陰性。整個保溫及拿取試管過程需避免振動，防止因振動導(dǎo)致凝膠破壞，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

二、BET計算
1、內(nèi)毒素限值（L）計算
內(nèi)毒素限值（L）的計算是細(xì)菌內(nèi)毒素檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其計算公式為：

其中，“K”表示人每千克體重或每平方米體表面積每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量。不同類型注射劑的K值有所差異：

• 注射劑K=5EU/(kg·h)
• 放射性藥品注射劑K=2.5EU/(kg·h)
• 鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/(kg·h)
• 按體表面積給藥時K=100EU/(m²·h)​

“M”為人用每千克體重或每平方米體表面積每小時的最大供試品劑量，M值需結(jié)合最大給藥劑量、人均體重（美國70kg，中國及日本60kg）及注射時間（不足1小時按1小時計）來確定。

2、最大有效稀釋（MVD）計算

其中，L為內(nèi)毒素限值，c為供試品溶液的濃度。

3、最小有效稀釋濃度（MVC）計算

其中，L為內(nèi)毒素限值，λ為靈敏度。

4、標(biāo)準(zhǔn)系列的稀釋倍數(shù)計算

例如，重組CSE小瓶中含有50EU/mL，λ為0.125EU/mL。該計算方法通過已知內(nèi)毒素濃度（50EU/mL）除以所需的內(nèi)毒素值（20λ或2.5EU/mL）確定稀釋倍數(shù)，即需進(jìn)行1:20稀釋以從重組CSE小瓶中獲得20λ標(biāo)準(zhǔn)液。

該溶液既可用于陽性對照制備（取10μL20λCSE加入100μL產(chǎn)品稀釋液形成2λ熱加標(biāo)，此加標(biāo)樣本應(yīng)呈現(xiàn)陽性），也可進(jìn)一步制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)系列：從20λ稀釋液進(jìn)行1:10稀釋得到2λ標(biāo)準(zhǔn)液，再通過1:2稀釋構(gòu)建完整標(biāo)準(zhǔn)系列。

三、方法開發(fā)注意事項(xiàng)
凝膠檢測方法的開發(fā)需充分了解產(chǎn)品特性，包括溶解度、潛在干擾因素、內(nèi)毒素限值、適用稀釋度以及pH范圍等，并與研發(fā)技術(shù)人員密切協(xié)作。

干擾篩查（抑制/增強(qiáng)）是方法開發(fā)的重要環(huán)節(jié)，通常通過MVD/MVC梯度稀釋（如1:2系列）來實(shí)施。

針對干擾問題，常用的解決方法是稀釋法。若稀釋法無法完全消除干擾，可通過調(diào)整pH至6-8（利用緩沖液或?qū)Ｓ迷噭�）或消除葡聚糖干擾等方式解決。

四、方法驗(yàn)證策略
驗(yàn)證批次要求在方法驗(yàn)證階段，通常使用三批產(chǎn)品進(jìn)行商業(yè)產(chǎn)品方法驗(yàn)證。對于臨床產(chǎn)品，若配方尚未定型，可采用單批次三次重復(fù)驗(yàn)證的方式。

pH值控制驗(yàn)證過程中，必須確保鱟試劑（LAL）與產(chǎn)品稀釋液混合后的pH值嚴(yán)格控制在6-8范圍內(nèi)。若在驗(yàn)證時需要調(diào)整pH值，后續(xù)常規(guī)檢測也必須采用相同的調(diào)整操作。

標(biāo)準(zhǔn)系列構(gòu)建與有效性判定驗(yàn)證時需同步構(gòu)建產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)系列和LRW內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)系列。產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)系列需在接種2λ內(nèi)毒素后進(jìn)行1:2梯度稀釋，直至λ、0.5λ、0.25λ濃度，各濃度及陰性對照（NPC）均需進(jìn)行四次重復(fù)；LRW內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)系列則進(jìn)行兩次重復(fù)。有效性判定要求產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)系列在2倍λ稀釋范圍內(nèi)均呈陽性，以此確保標(biāo)準(zhǔn)系列的有效性和檢測方法的可靠性。

若檢測結(jié)果無效，需全面排查潛在因素，包括移液誤差、操作失誤、標(biāo)準(zhǔn)品效價不足、污染或稀釋錯誤等，及時糾正問題，重新進(jìn)行檢測，直至獲得可靠的檢測結(jié)果。圖1展示了產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)系列和LRW標(biāo)準(zhǔn)系列的試管設(shè)置，為驗(yàn)證過程提供直觀參考。