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	細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)
當(dāng)單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上,其后代所組成的細(xì)胞群體,成為集落或克隆。每個(gè)克隆含有50以上的細(xì)胞,大小在0.3-1.0mm之間。集落形成率表示細(xì)胞的獨(dú)立生存能力。
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實(shí)驗(yàn)介紹 

       當(dāng)單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上,其后代所組成的細(xì)胞群體,成為集落或克隆。每個(gè)克隆含有50以上的細(xì)胞,大小在0.3-1.0mm之間。集落形成率表示細(xì)胞的獨(dú)立生存能力。各種理化因素可能導(dǎo)致細(xì)胞的克隆形成能力發(fā)生改變。通過(guò)一定的實(shí)驗(yàn)方法可以對(duì)細(xì)胞的克隆形成能力進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)方法:

      平板集落形成實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)

 (a) 平板集落形成實(shí)驗(yàn):本法適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞和正常培養(yǎng)的細(xì)胞

 (b) 軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn):本法適用于非錨著依賴(lài)性生長(zhǎng)的細(xì)胞,如骨髓造血干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞株、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。

注意事項(xiàng):

 (a) 瓊脂對(duì)熱和酸不穩(wěn)定,若反復(fù)加熱,容易降解而產(chǎn)生毒性,且硬度下降。因此高壓滅菌后應(yīng)進(jìn)行分裝;

 (b) 細(xì)胞在進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)時(shí)要求有95%以上的分散度,否則結(jié)果的準(zhǔn)確度會(huì)受到很大影響;

 (c) 軟瓊脂與細(xì)胞混合時(shí)溫度不能超過(guò)40℃,否則將會(huì)燙傷/死細(xì)胞;

 (d) 接種時(shí)細(xì)胞密度適度,不可過(guò)高。

細(xì)胞在低密度、非貼壁狀態(tài)條件下培養(yǎng),生存率明顯下降,永生細(xì)胞系/株克隆形成率可達(dá)到10%以上,但初代培養(yǎng)細(xì)胞和有限傳代細(xì)胞系克隆形成率僅為0.5%-5%,甚至無(wú)法形成單個(gè)克隆。因此,為了提高克隆形成率,有時(shí)需要在培養(yǎng)基中添加胰島素、地塞米松等促克隆形成物質(zhì)。

細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù),但貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞?寺⌒纬陕史从臣(xì)胞群體依賴(lài)性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同,細(xì)胞克隆形成率差別也很大,一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱,傳代細(xì)胞系強(qiáng);二倍體細(xì)胞克隆形成率弱,轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng);正常細(xì)胞克隆形成率弱,腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。并且克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系,做克隆形成率測(cè)定時(shí),接種細(xì)胞一定要分散成單細(xì)胞懸液,直接接種在碟皿中,持續(xù)一周,隨時(shí)檢查,到細(xì)胞形成克隆時(shí)終止培養(yǎng)。

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【本平臺(tái)合作項(xiàng)目】

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