cDNA文庫構(gòu)建

        構(gòu)建cDNA文庫是研究功能基因組學(xué)的基本手段之一。cDNA便于克隆和大量表達(dá)，它不像基因組含有內(nèi)含子而難于表達(dá)，因此可以從cDNA文庫中篩選到所需的目的基因，并直接用于該目的基因的表達(dá)。SMART技術(shù)的出現(xiàn)是一個(gè)新的里程碑。它的原理也非常簡單：在合成cDNA的反應(yīng)中事先加入的3’末端帶Oligo（dG）的SMART引物，由于逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成cDNA，在到達(dá)mRNA的5’末端時(shí)碰到真核mRNA特有的“帽子結(jié)構(gòu)”， 即甲基化的G時(shí)會(huì)連續(xù)在合成的cDNA末端加上幾個(gè)（dC），SMART引物的Oligo（dG）與合成cDNA末端突出的幾個(gè)C配對(duì)后形成cDNA的延伸模板，逆轉(zhuǎn)錄酶會(huì)自動(dòng)轉(zhuǎn)換模板，以SMART引物作為延伸模板繼續(xù)延伸cDNA單鏈直到引物的末端，這樣得到的所有cDNA單鏈的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二鏈后可以利用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。由于有5’帽子結(jié)構(gòu)的mRNA才能利用這個(gè)反應(yīng)得到能擴(kuò)增的cDNA，因此擴(kuò)增得到的cDNA就是全長cDNA。這個(gè)方法是利用逆轉(zhuǎn)錄酶內(nèi)源的末端轉(zhuǎn)移酶活性實(shí)現(xiàn)的，只要單管，一步即可完成，不需要額外的cDNA抽提純化或者沉淀，或者額外的酶反應(yīng)，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高質(zhì)量、高產(chǎn)量的cDNA庫，更重要的是得到的cDNA能夠代表原有樣品中的mRNA的豐度，可以應(yīng)用于直接擴(kuò)增基因、構(gòu)建cDNA文庫、已知序列釣全長cDNA（RACE），和用于芯片檢測的cDNA探針的擴(kuò)增等。