教學(xué)實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)真菌的鑒定與保藏方法！

                                      教學(xué)實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)真菌的鑒定與保藏方法！

醫(yī)學(xué)真菌作為自然界重要的生物資源，已成為微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中不可或缺的基本材料，應(yīng)用頻率較高。這其中部分為病原性真菌，而如何有效地保存保管好真菌菌種，以何種方式長(zhǎng)期穩(wěn)定地保持其生物遺傳特性，則成為我們?nèi)粘９ぷ髦行枰�研究探討的問題。

一、材料與方法

1、教學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存的菌種     
⑴單細(xì)胞真菌：白色念珠菌、新生隱球菌。
⑵多細(xì)胞真菌：黑曲霉菌、青霉菌、木霉菌。

2、醫(yī)學(xué)真菌菌種的鑒定     
菌種使用前，均需進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生化學(xué)方面的鑒定，合格后方可使用。具體鑒定方法：(1)單細(xì)胞真菌：碳源發(fā)酵試驗(yàn)、產(chǎn)子囊孢子及芽管試驗(yàn)、咖啡酸試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)；單細(xì)胞與多細(xì)胞真菌鑒定共用實(shí)驗(yàn)：玉米粉吐溫80瓊脂小培養(yǎng)顯微鏡下觀察。(2)多細(xì)胞真菌：蛋白水解試驗(yàn)、37℃生長(zhǎng)試驗(yàn)、溫度試驗(yàn)、PDA小培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

3、真菌菌種的保藏方法     
由于教學(xué)實(shí)驗(yàn)各時(shí)期使用的真菌菌種在數(shù)量及種類上不盡相同，所以與其相適應(yīng)的培養(yǎng)方法與保管方式亦不相同。大體上分為定期傳代保存法、超低溫凍結(jié)保存法兩種。

⑴定期傳代保存法     
①液體培養(yǎng)基保存法：?jiǎn)渭?xì)胞真菌接種于RPMI 1640培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24 h，取出后置4℃冰箱保存。該方法用于學(xué)期初低溫凍結(jié)菌種的復(fù)蘇、增菌培養(yǎng)。
②瓊脂平板培養(yǎng)基保存法：學(xué)期開始，多細(xì)胞凍結(jié)菌種解凍后，劃線接種于察氏平板培養(yǎng)基上面，28℃培養(yǎng)7～8  d，再將培養(yǎng)菌絡(luò)移種于改良馬丁平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d，待培養(yǎng)菌絡(luò)生長(zhǎng)良好,置4℃冰箱保存。為多細(xì)胞真菌的復(fù)蘇與鑒定試驗(yàn)。
③瓊脂斜面培養(yǎng)基保存法：?jiǎn)渭?xì)胞真菌由液體培養(yǎng)基中多細(xì)胞真菌從馬丁培養(yǎng)基表面，分別挑取菌種菌絡(luò)，蜿蜒化線接種于各自相對(duì)應(yīng)的瓊脂斜面培養(yǎng)基中,經(jīng)37℃或28℃培養(yǎng)生長(zhǎng)良好后，置4℃冰箱保存?zhèn)溆�。該方法用于學(xué)期中，真菌菌種即將使用，實(shí)驗(yàn)課前的菌種純化和制備階段。
④液體石蠟覆蓋保存法：將無菌液體石蠟油覆蓋于菌絡(luò)生長(zhǎng)良好的瓊脂斜面真菌培養(yǎng)物表面，厚度約1 cm左右，置4℃冰箱保存。該法用于學(xué)期末對(duì)真菌菌種較長(zhǎng)時(shí)期的保存方法。

⑵液氮超低溫凍結(jié)保存法     
將單細(xì)胞或多細(xì)胞真菌培養(yǎng)物,以無菌生理鹽水洗下并計(jì)數(shù)，加入等量脫脂牛奶保護(hù)劑，分裝進(jìn)安瓿后封口。選擇菌種不同的適宜冷卻速度，使瓿內(nèi)菌懸液急速或慢速凍結(jié)成冰。置液氮超低溫下保存。
 
二、結(jié)果
      
1、定期傳代保存法     
⑴液體培養(yǎng)基保存法，可保存單細(xì)胞真菌15 d左右。
⑵瓊脂平板培養(yǎng)基保存法，保存多細(xì)胞真菌15 d。
⑶瓊脂斜面培養(yǎng)基保存法，保存單細(xì)胞、多細(xì)胞真菌1個(gè)月。
⑷液體石蠟覆蓋保存法，可保存真菌菌種6個(gè)月。

2、液氮超低溫凍結(jié)保存法     
可保存凍結(jié)菌種1年。

三、小結(jié)
        
一般認(rèn)為，傳代移種保存法保存的菌種，易失去病原性，而超低溫保存法能夠完整的保存菌種的致病性。為此，我們針對(duì)實(shí)驗(yàn)的初、中、末3個(gè)時(shí)期，對(duì)菌種的保存選擇不同的保存方法，優(yōu)化了菌種的遺傳特性不變性。
            
實(shí)驗(yàn)顯示，反復(fù)的移種傳代會(huì)使菌種的致病力和生理活性下降，孢子形成能力減弱，故超低溫凍結(jié)保存菌種，是最佳保藏菌種的方法，唯一不足的是菌種復(fù)蘇啟動(dòng)時(shí)間較長(zhǎng)。

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