轉(zhuǎn)染小鼠單核巨噬細胞J774A.1專用轉(zhuǎn)染試劑方法-

 轉(zhuǎn)染小鼠單核巨噬細胞J774A.1專用轉(zhuǎn)染試劑方法-上海轉(zhuǎn)染生物科技有限公司
原標題：轉(zhuǎn)染小鼠單核巨噬細胞J774A.1專用轉(zhuǎn)染試劑方法-上海轉(zhuǎn)染生物科技有限公司
ZetaLife Advanced DNA RNA Transfection Reagent
儲存條件
4℃保存，拒絕反復凍融。
材料準備
1.siRNA、miRNA或者小分子濃度20 uM /L。
2.質(zhì)粒DNA 濃度300 ng-2 ug/ul（注意：①溶解于無菌雙蒸水或超純水；②無內(nèi)毒素 ），推薦500ng/ul左右。
操作步驟
1.提前1天接種細胞：細胞匯合度在60-80%左右（根據(jù)不同細胞生長速度需調(diào)整起始密度），再進行轉(zhuǎn)染。
2. 核酸復合物制備：將核酸與轉(zhuǎn)染試劑按照1:1關系直接混合，用移液器吹吸10-15次混勻，室溫靜止10-15分鐘。
3.在細胞培養(yǎng)基中加入核酸復合物：根據(jù)參考用量在細胞中加入核酸復合物，并輕輕混勻；細胞培養(yǎng)基里面可以含有血清。
4.細胞換液：轉(zhuǎn)染24小時后對細胞進行正常換液，懸浮細胞轉(zhuǎn)染過程中不用換液。
5.分析結(jié)果：質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染48-72小時后熒光檢測轉(zhuǎn)染效率，48-96小時檢測mRNA或蛋白表達。若進行穩(wěn)定表達細胞株的篩選，則在轉(zhuǎn)染后24-48小時左右加入適量的藥物進行篩選。siRNA轉(zhuǎn)染后9小時熒光檢測轉(zhuǎn)染效率，48-72小時檢測mRNA或蛋白表達。
注意事項
 1、質(zhì)粒DNA必須溶解于無菌雙蒸水或超純水，但不能溶解于提取試劑盒提供的Buffer。溶解于Buffer的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率會下降80%左右，甚至會轉(zhuǎn)染失敗。
 2、質(zhì)粒必須去除內(nèi)毒素，內(nèi)毒素對細胞將產(chǎn)生很大的細胞毒性，會導致轉(zhuǎn)染效率下降70%-80%左右，甚至導致轉(zhuǎn)染失敗（推薦使用Qiagen、TIANGEN、Omega去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒）。
 3、復合物的制備過程中是絕對不能用其他任何試劑對核酸或轉(zhuǎn)染試劑進行稀釋，只需將核酸和轉(zhuǎn)染試劑兩者按1:1比例直接混合，如果進行了稀釋會導致轉(zhuǎn)染失。
4、轉(zhuǎn)染試劑與核酸混勻后用移液器吹打10-15次，室溫孵育10-15分鐘后即可加入細胞培養(yǎng)板。
 5、轉(zhuǎn)染24小時后進行正常換液，不能像Lipo2000一樣轉(zhuǎn)染4-6小時后換液。
 6、原代細胞、免疫細胞轉(zhuǎn)染時，細胞基礎培養(yǎng)基里面不能含有雙抗培養(yǎng)基。