支原體污染的危害
支原體是實(shí)驗(yàn)室中常見的污染細(xì)胞的原核生物,據(jù)統(tǒng)計(jì)約有15%-35%的細(xì)胞被支原體污染。支原體會(huì)改變宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能等一系列特征,造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確;干擾細(xì)胞代謝和生長(zhǎng),改變核酸合成,影響細(xì)胞抗原性,導(dǎo)致染色體改變,干擾病毒復(fù)制以及模仿病毒的作用。因此,每一株外來細(xì)胞在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室之前,都應(yīng)進(jìn)行支原體檢測(cè),并且應(yīng)對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞定期(如每2-3個(gè)月)進(jìn)行支原體檢測(cè)服務(wù)。
建立定期的監(jiān)控方案,有助于提高科研效率,在污染發(fā)生早期及時(shí)處理,可避免支原體污染造成更大損失!
原理
利用qPCR(TaqMan探針法)檢測(cè)支原體DNA,反應(yīng)體系中同時(shí)存在標(biāo)記兩種顏色TaqMan探針及相關(guān)引物,分別檢測(cè)支原體DNA和內(nèi)模板。
支原體檢測(cè)優(yōu)勢(shì)
1、靈敏度:qPCR法最低的穩(wěn)定檢測(cè)至10拷貝的支原體DNA。
2、穩(wěn)定:qPCR法全程閉管操作,無產(chǎn)物交叉污染。
3、可靠:通過內(nèi)參擴(kuò)增效率的檢測(cè),可有效檢測(cè)試劑盒質(zhì)量,樣本中各類PCR抑制劑的影響,避免假陰性。
4、方便:操作簡(jiǎn)單,無需后期跑電泳步驟。
5、定量:通過CT值判斷,可進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果可分為:陰性、弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性,給科研人員提供更多的有用信息。
結(jié)果判斷
PCR模板 |
支原體(FAM)CT值 |
判定說明 |
陽性對(duì)照 |
26±3 |
陽性成立 |
>30 |
陽性不成立 |
陰性對(duì)照 |
>34 |
陰性成立 |
<34 |
陰性不成立 |
待測(cè)樣品
(內(nèi)參CT值<30) |
>34 |
陰性 |
30-33 |
灰區(qū),需驗(yàn)證 |
25-29 |
弱陽性 |
19-24 |
陽性 |
<19 |
強(qiáng)陽性 |
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