缺口末端標(biāo)記法TUNEL技術(shù)服務(wù)

TUNEL技術(shù)服務(wù)

脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）

服務(wù)類別：	分子與細(xì)胞	總訪問：	1777
最后更新：	2009-9-15	半年訪問：	12
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服務(wù)商：尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)（北京）有限公司

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服務(wù)介紹
公司簡介

TUNEL技術(shù)服務(wù)

◆ 概述
    細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進(jìn)的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30%的染色體DNA在Ca2+和Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進(jìn)行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的DNA標(biāo)記或染色，然后分析凋亡細(xì)胞。

    TUNEL或缺口翻譯法實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測定法要高，因而在細(xì)胞凋亡的研究中已被廣泛采用。

◆ 操作流程
    ● 標(biāo)本處理
    （1）石蠟包埋的組織切片預(yù)處理：將組織切片置于染色缸中，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min，無水乙醇Ⅰ3min，無水乙醇Ⅱ3min，95％乙醇3min，75％乙醇3min，PBS洗5min。加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室溫水解15min，用蒸餾水洗4次，每次2min，然后進(jìn)行步驟2操作。
    （2）冰凍組織切片預(yù)處理：將冰凍組織切片置10％中性甲醛中，于室溫固定10min后，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃處理5min，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min，然后進(jìn)行步驟2操作。
    （3）培養(yǎng)的或從組織分離的細(xì)胞的預(yù)處理：將約 5×107個/ml細(xì)胞于 4％中性甲醛室溫中固定 10min。在載玻片上滴加 50～100μl細(xì)胞懸液并使之干燥。用PBS洗兩次，每次5min，然后進(jìn)行步驟2操作。
    ● 加入含3％H2O2的PBS，室溫下5min。PBS洗兩次，每次5min。
    ● 用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，立即在切片上加2滴TdT酶緩沖液，置室溫1～5min。
    ● 用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反應(yīng)液，置濕盒中于37℃反應(yīng) 1hr（陰性染色對照，加不含TdT酶的反應(yīng)液）。
    ● 將切片置于染色缸中，加入已預(yù)熱到37℃的洗滌與終止反應(yīng)緩沖液，37℃30min，每10min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動。
    ● PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應(yīng)30min。
    ● 用PBS洗4次，每次5min。
    ● 在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05％DAB溶液，室溫顯色3～6min。
    ● 用蒸餾水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。
    ● 于室溫用甲基綠進(jìn)行復(fù)染10min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，最后1次靜置30s。依同樣方法再用100％正丁醇洗三次。
    ● 脫水透明，干燥后封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗結(jié)果。

◆ TUNEL注意事項
    ● 使用PH中性的固定液固定組織或者細(xì)胞，避免使用酸性或者堿性固定液，以免出現(xiàn)人為DNA損傷；推薦使用3.7％甲醛溶液）
    ● 在操作過程中避免出現(xiàn)干片現(xiàn)象
    ● 根據(jù)標(biāo)本類型決定孵育時間（蛋白酶K、TdT等），保證最佳效果
    ● 使用過程避免將TdT酶置于冰上；避免反復(fù)凍溶。
    ● 使用試劑盒提供的二價陽離子優(yōu)化標(biāo)記反應(yīng)（Mg2+可降低背景，Mn2+可增強(qiáng)染色；建議使用Co2+開始反應(yīng)）
    ● 按照正確的順序準(zhǔn)備標(biāo)記混合物；最后一步加入標(biāo)記緩沖液
    ● 使用新鮮的H₂O₂溶液，孵育后立即將標(biāo)本放入PBS清洗（H2O2可導(dǎo)致DNA損傷）

尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)（北京）有限公司創(chuàng)建于2000年，已經(jīng)獲得國家經(jīng)營三類醫(yī)療器械許可(證號：京081876)和北京市科學(xué)技術(shù)委員會認(rèn)定的高新技術(shù)企業(yè)(統(tǒng)一編號：0611008A21672)。公司總部位于高校云集的北京市海淀區(qū)中關(guān)村科技園區(qū)，座落于中國鐵路建設(shè)總公司鐵建醫(yī)院。與軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、301醫(yī)院、305醫(yī)院等國內(nèi)外知名的科研單位和醫(yī)院緊密為鄰。2007年7月11日，SUNBIO正式被北京中醫(yī)藥大學(xué)授權(quán)為"國家基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)人才培養(yǎng)實(shí)訓(xùn)基地"，SUNB IO不斷積累和總結(jié)實(shí)習(xí)帶教經(jīng)驗，使學(xué)生的理論知識和人生閱歷通過SUNBIO這個平臺得到實(shí)踐和豐富。SUNBIO將不斷加強(qiáng)實(shí)訓(xùn)基地的基礎(chǔ)設(shè)施和人才隊伍的建設(shè)，逐步完善實(shí)習(xí)教學(xué)模式，爭取成為更多基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)教學(xué)示范單位的人才培養(yǎng)基地。

尚柏生物致力于尖端免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)在科研中的應(yīng)用與推廣，專業(yè)從事免疫檢測及其他相關(guān)產(chǎn)品的引進(jìn)、服務(wù)和研發(fā)。目前已經(jīng)擁有自主知識產(chǎn)權(quán)專利產(chǎn)品6項。尚柏生物公司是一家深受客戶信任的高質(zhì)量服務(wù)供應(yīng)商，通過高度細(xì)分、全方位的服務(wù)平臺，向生物制藥和醫(yī)療儀器公司提供生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品測試，合同研究及開發(fā)，以及生物 cGMP 生產(chǎn)服務(wù)。

SUNBIO生命科學(xué)實(shí)驗中心作為尚柏生物的核心技術(shù)平臺，由加拿大籍華人投資人民幣800萬元，擁有專業(yè)的實(shí)驗室、潔凈的動物房和一流的實(shí)驗設(shè)備（實(shí)驗室總面積達(dá)200平方米擁有儀器設(shè)備20余臺，較大型儀器設(shè)備有：熒光定量PCR儀器、CO2培養(yǎng)箱、超低溫冰箱、熒光顯微鏡、高速冷凍離心機(jī)、PCR儀、垂直電泳儀、自動生化分析儀、紫外分光光度計、酶標(biāo)儀、超凈工作臺等）和經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員，其中助理研究員（博士）4人，實(shí)驗師（碩士）12人，已經(jīng)發(fā)表的SCI文章6篇，國家核心期刊文章20余篇,完整的實(shí)驗記錄多達(dá)5000多份�？蒲许椖亢w臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等生命科學(xué)諸多領(lǐng)域，具體的實(shí)驗方法有：普通PCR、熒光定量PCR（real-time PCR）、Western印跡、流式、ELISA、免疫組化、細(xì)胞培養(yǎng)、MTT、放免、實(shí)驗動物飼養(yǎng)及造模等。同時本實(shí)驗室人員有豐富的新藥研發(fā)企業(yè)工作經(jīng)驗，能夠承擔(dān)新藥藥效學(xué)及毒理學(xué)實(shí)驗，提供新藥申報資料、文獻(xiàn)查詢及綜述內(nèi)容的整理服務(wù)。

SUNBIO生命科學(xué)翻譯中心作為尚柏生物旗下全資子公司，專門從事醫(yī)學(xué)、醫(yī)藥類口筆譯的專業(yè)化翻譯公司長期以來，SUNBIO翻譯中心為衛(wèi)生部、藥品監(jiān)督管理局下屬多家單位及多家著名跨國醫(yī)藥企業(yè)提供口、筆譯服務(wù)，獲得一致好評。SUNBIO翻譯中心以國內(nèi)知名醫(yī)科、藥科院校，科研院、研究所翻譯專家、教授，醫(yī)學(xué)博士,藥學(xué)博士及外籍（美、英、德、日、韓等）專家為主要依托，云集國內(nèi)中西醫(yī)專業(yè)翻譯人才，以及國外留學(xué)回國人員，致力于國內(nèi)外中西醫(yī)基礎(chǔ)理論、醫(yī)療、制藥、生物技術(shù)、醫(yī)療器械、化妝品、食品衛(wèi)生、獸醫(yī)等醫(yī)藥相關(guān)行業(yè)的專業(yè)化翻譯服務(wù)。SUNBIO翻譯中心可提供英、日、韓、法、德、俄、意、西班牙等十余種語言的口譯、筆譯服務(wù)。SUNBIO翻譯中心堅持奉行“專業(yè)、嚴(yán)謹(jǐn)、快捷”的宗旨，憑借裝備精良的專業(yè)化翻譯隊伍，以SUNBIO嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖黠L(fēng)，為客戶提供快捷、足不出戶的翻譯產(chǎn)品和服務(wù)。SUNBIO翻譯中心視質(zhì)量為企業(yè)生存之根，效率為生存之本，按照GB/T19002-1994 idt IS9002:1994 標(biāo)準(zhǔn)的要求，建立了先進(jìn)的質(zhì)量管理體系和內(nèi)部管理制度，并全面運(yùn)用全球最先進(jìn)的塔多思(TRADOS)翻譯記憶軟件，以及Freehand、Pagemaker、CorelDraw等制圖排版軟件，竭誠為海內(nèi)外廣大客戶提供最佳的專業(yè)化翻譯產(chǎn)品和高品質(zhì)的翻譯服務(wù)。

公司充分依托裝備精良的研究平臺，結(jié)合自身的技術(shù)優(yōu)勢和精良的人力資源，始終不懈的跟蹤生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)展的最前沿。目前，公司承擔(dān)眾多科研院校的國家863、973等科研項目的技術(shù)服務(wù)，通過我們的高效服務(wù)，全國眾多客戶在EJP, JBC等雜志上發(fā)表了影響因子較高的SCI論文。協(xié)助近百名研究生進(jìn)行科研選題和課題合作服務(wù)，這些研究生在畢業(yè)答辯時都獲得了答辯組專家好評，其中一位已獲得全國優(yōu)秀博士論文榮譽(yù)。

我們所做的一切都是為了使您的工作更輕松、更快捷。良知使我們不斷拿出和引進(jìn)更好的產(chǎn)品，控制和降低各種成本，為您的研究加油，加速我國自有成果的開發(fā)，最終擺脫對進(jìn)口產(chǎn)品的依賴。這是一項長期艱苦的工作，這是一項光榮偉大的工作，這是我們繼續(xù)發(fā)展的動力。

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