SMP檢測-高分辨熔解曲線突變檢測法

       高分辨熔解(high-resolution melt, HRM)分析技術(shù)是近幾年來在國外興起的一種用于突變掃描和基因分型的最新遺傳學(xué)分析方法。它是一種高效穩(wěn)健的post-PCR技術(shù)，不受突變堿基位點與類型的局限，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運行高分辨熔解，即可完成對樣品基因型的分析。這種方法因其操作簡便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確，并且實現(xiàn)了真正的閉管操作，使其用于臨床常規(guī)化檢測成為可能。

高分辨率溶解曲線（高分辨溶解曲線突變檢測）是理想的SNP檢測手段：

Ø    儀器設(shè)備—LightScanner Instrument 96；專利的熒光染料技術(shù)，專利的高分辨PCR產(chǎn)物溶解曲線基因突變檢測（Utah University）技術(shù)；LightScanner Call IT軟件和專門用于HRM引物設(shè)計軟件

Ø    快速、高通量—LightScanner 5分鐘完成96/384孔板的PCR產(chǎn)物檢測， 20000個SNP/天

Ø    準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性好—LightScanner 100%準(zhǔn)確性、特異性（<400bp）；準(zhǔn)確性96.4%和特異性99.1%（400~1kb）；腫瘤研究中低突變率樣品基因突變檢測，最低檢測到0.1%的突變樣品基因突變

Ø    重復(fù)性好—LightScanner重復(fù)性100%

Ø    操作簡便—LightScanner只需將PCR產(chǎn)物（96/384孔板）放入儀器內(nèi)便可，軟件自動基因分型

Ø    只檢測PCR樣品中熒光強(qiáng)度的變化，不消耗任何PCR樣品，無污染，PCR產(chǎn)物可以進(jìn)行下游分析

原理：

       HRM的主要原理是根據(jù)DNA序列的長度，GC含量以及堿基互補(bǔ)性差異，應(yīng)用高分辨率的熔解曲線對樣品進(jìn)行分析，其分辨精度可以達(dá)到對單個堿基差異的區(qū)分。同許多熒光PCR技術(shù)一樣，HRM是利用了特定的染料可以插入DNA雙鏈中的特性，從而對樣品進(jìn)行檢測。隨著高精度PCR儀（Rotor-Gene 6000和Lightscanner）和飽和染料（LC Green,Eva green）的出現(xiàn)為HRM這一技術(shù)的普及使用成為可能。由于HRM完全是基于核酸的物理性質(zhì)進(jìn)行分析，因而無需序列特異性探針。基于這種檢測原理，HRM檢測不受突變堿基位點和種類的局限，既可以對未知突變進(jìn)行篩查、掃描，又可以對已知突變進(jìn)行分析，亦可用于短片段重復(fù)序列的分析，所需要的只是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上增加一個飽和染料。    

實驗流程：

      在PCR反應(yīng)前將LC Green熒光染料與反應(yīng)Buffer、引物、模版DNA混合，LC Green染料飽和加入（LC Green熒光染料對PCR不會有任何抑制作用），然后將PCR產(chǎn)物（96孔板或者384孔板）直接放入LightScanner或HR-1儀器中，在一定的溫度范圍內(nèi)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性，在此期間，儀器的光學(xué)檢測系統(tǒng)采集密集的熒光信號變化并繪制溫度熔解曲線，根據(jù)曲線準(zhǔn)確區(qū)分野生型、雜合突變、純和突變，軟件自動分型。 LightScanner為高通量、高分辨率、高靈敏度檢測手段，通過上述檢測分型之后，只有約1%的PCR產(chǎn)物需要測序，因此極大的降低了測序的工作量。 

樣品要求：

      PCR產(chǎn)物濃度均一，無非特異性擴(kuò)增，檢測片段范圍50bp~1000bp。