銀杏葉提取物改善學(xué)習(xí)記憶障礙的實(shí)驗(yàn)研究

摘要　為了探討銀杏葉提取物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)高級(jí)機(jī)能活動(dòng)的作用, 為臨床應(yīng)用銀杏葉提取物治療認(rèn)知功能障礙提供實(shí)驗(yàn)依據(jù), 采用東莨菪堿所致老齡大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的擬老年性癡呆動(dòng)物模型, 以水迷宮和避暗實(shí)驗(yàn)等學(xué)習(xí)記憶行為訓(xùn)練及生化檢測(cè)方法, 觀察用藥前后動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶行為和海馬乙酰膽堿及蛋白質(zhì)含量的變化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示: 銀杏葉提取物呈劑量依賴性顯著改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力 (P < 0105 或P < 0101) , 并顯著增加海馬腦區(qū)乙酰膽堿含量(P < 0105 或P < 0101)。結(jié)果表明: 銀杏葉提取物可改善癡呆鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙。

關(guān)鍵詞　銀杏葉提取物，乙酰膽堿，學(xué)習(xí)記憶障礙

銀杏是一種具有多種藥理作用的中藥, 從銀杏葉中提取的主要藥用成分為總黃酮類(lèi)及銀杏內(nèi)酯等, 簡(jiǎn)稱為銀杏葉提取物(ex t ract s of ginkgo b iloba leaves,EGB)。近年研究顯示, EGB 是一種天然的自由基清除劑, 可保護(hù)機(jī)體免受自由基引起的損害, 改善腦循環(huán)障礙和神經(jīng)元的功能, 目前國(guó)內(nèi)外已將EGB 廣泛應(yīng)用于治療冠心病和腦缺血, 而關(guān)于EGB 對(duì)認(rèn)知功能等高級(jí)神經(jīng)功能活動(dòng)影響的實(shí)驗(yàn)或臨床研究少見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討EGB 對(duì)擬老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響, 并初步研究其可能機(jī)制, 為臨床合理應(yīng)用EGB 提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: 老年雄性W istar 大鼠, 月齡約20～24月, 體重650～820 g (幼齡鼠喂養(yǎng)至老齡) , 老年性癡呆動(dòng)物模型參考 [ 1 ]的方法建立。

1.1.2　藥物: 銀杏葉提取物EGB (含總黃酮甙24% ,總內(nèi)酯60% ); 東莨菪堿。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1　實(shí)驗(yàn)分組: 將大鼠隨機(jī)分為5 組: 正常老齡對(duì)照組、模型組、EGB 小劑量組 (75m gö kg)、EGB中劑量組 (150 m gö kg) , EGB 大劑量組 (500 m gökg) , 每組8 只, 采用灌胃給藥, 其中正常老齡對(duì)照組和模型組以相同體積的生理鹽水灌胃, 單次連續(xù)給藥5 d, 于第6 d 測(cè)試水迷宮及避暗試驗(yàn), 測(cè)試期間停止灌藥。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于 (22±3) ℃環(huán)境中, 自由飲水, 自然光照。

1.2.2　學(xué)習(xí)記憶行為訓(xùn)練與學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)定: ①分辨學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練與評(píng)估: 采用水迷宮法測(cè)試藥物對(duì)擬癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。以癡呆大鼠自水迷宮起點(diǎn)游至終點(diǎn)安全臺(tái)所需時(shí)間和途中進(jìn)入盲端的錯(cuò)誤次數(shù), 作為衡量學(xué)習(xí)獲得與記憶鞏固能力的指標(biāo)。②回避反應(yīng): 采用避暗試驗(yàn)測(cè)試藥物對(duì)擬癡呆大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力的影響。以大鼠到達(dá)暗環(huán)境被動(dòng)回避試驗(yàn)所需時(shí)間和電擊次數(shù), 作為大鼠學(xué)習(xí)獲得和記憶鞏固能力的觀察指標(biāo)。

1.2.3　海馬乙酰膽堿、蛋白質(zhì)含量測(cè)定

改進(jìn)的方法, 通過(guò)堿羥胺比色法測(cè)定海馬的乙酰膽堿含量。海馬蛋白含量測(cè)定方法如下: 在完成各實(shí)驗(yàn)步驟后, 將各組大鼠快速斷頭處死, 取海馬部位分別稱重, 加入T r is2 HCl緩沖液 (pH712) 研磨勻漿,離心、過(guò)濾。Low ry 法測(cè)定海馬腦區(qū)的蛋白質(zhì)含量。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用 x q±s 表示, 數(shù)據(jù)處理采用 t檢驗(yàn)及方差分析, 顯著性水平為 P < 0105 或 P <0101。

2　結(jié)果

2.1　EGB對(duì)東莨菪堿 (Scop) 所致學(xué)習(xí)記憶障礙老齡鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

　　連續(xù)7 d 的水迷宮試驗(yàn)發(fā)現(xiàn): EGB 各劑量組造模大鼠游迷宮所需時(shí)間和途中錯(cuò)誤次數(shù)均明顯少于模型組 (P < 0105 或P < 0101) , EGB 大、中、小劑量組相互比較, 差異均具有顯著性意義 (P < 0105 或P< 0101)。模型組與正常老齡對(duì)照組比較, 前者大鼠游迷宮所需時(shí)間和途中錯(cuò)誤次數(shù)明顯高于后者 (P <0101) 。

　　EGB 大、中、小劑量組造模大鼠為達(dá)到暗環(huán)境被動(dòng)回避試驗(yàn)內(nèi)容, 學(xué)習(xí)過(guò)程明顯短于模型組 (P <0105或P < 0101)。EGB 大、中、小劑量組學(xué)會(huì)所需時(shí)間相互比較均有明顯差別 (P<0101) , 模型組學(xué)習(xí)時(shí)間較正常老年對(duì)照組顯著延長(zhǎng)(P < 0101) ; EGB各劑量組發(fā)生電擊的錯(cuò)誤次數(shù)也明顯少于模型組 (P<0101) , EGB 大劑量組電擊次數(shù)顯著少于中劑量組(P < 0101) 中劑量組明顯少于小劑量組 (P < 0105) 。

2.2　EGB 對(duì)Scop 所致學(xué)習(xí)記憶障礙老齡鼠海馬腦區(qū)乙酰膽堿 (Ach) 及蛋白質(zhì)含量的影響

　　EGB 大、中、小劑量組造模大鼠海馬A ch 含量明顯高于模型組 (P < 0105 或P < 0101) , 而EGB 大劑量組的海馬A ch 含量顯著高于EGB 中、小劑量組(P < 0101)。另外, 與正常老齡對(duì)照組比較, 東莨菪堿致學(xué)習(xí)記憶障礙模型組大鼠海馬腦區(qū)的蛋白質(zhì)含量顯著降低 (P < 0101) , 在給予EGB 后, 造模后的實(shí)驗(yàn)大鼠海馬腦區(qū)蛋白質(zhì)含量雖有所增加, 但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P > 0105) ,

3　討論

銀杏是地球上存活最久的植物之一, 銀杏葉始載于《本草品匯精要》 , 作為祖國(guó)的傳統(tǒng)中藥已沿用數(shù)千年。由于銀杏葉的有效成分已基本確認(rèn), 近年來(lái)出現(xiàn)了一些關(guān)于銀杏葉的臨床藥理學(xué)及應(yīng)用研究。有跡象表明[4], 銀杏葉提取物EGB 可能有提高學(xué)習(xí)記憶功能的作用, 但其具體機(jī)制有待深入探討, 尤其EGB對(duì)老年性癡呆型學(xué)習(xí)記憶功能障礙的防治機(jī)理少見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。

制作接近人類(lèi)老年性癡呆的理想動(dòng)物模型直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的可靠性和實(shí)用價(jià)值, 近年來(lái)雖已建立多種擬老年性癡呆動(dòng)物模型, 但多數(shù)僅能模擬老年性癡呆的生化、病理等某一方面改變, 因而對(duì)老年性癡呆發(fā)病機(jī)制及防治措施的深入研究有待開(kāi)發(fā)更理想的動(dòng)物模型。據(jù)報(bào)道[ 5 ], 通過(guò)抗膽堿能藥物東莨菪堿建立的大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型可作為研究老年性癡呆智能障礙的有效動(dòng)物模型之一。本實(shí)驗(yàn)采用老齡大鼠造模, 更符合擬老年性癡呆動(dòng)物的老齡特點(diǎn), 也更接近人類(lèi)老年性癡呆患者的機(jī)能狀態(tài)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn): 模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著低于正常老齡對(duì)照組, 提示本造模法穩(wěn)定可靠, 適用于學(xué)習(xí)記憶等高級(jí)神經(jīng)功能活動(dòng)的研究。本研究通過(guò)水迷宮及避暗試驗(yàn)發(fā)現(xiàn): EGB 能有效改善癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力, 提示EGB 在一定程度上可緩解癡呆老齡大鼠的智能障礙, 在 75～ 500m gö kg 范圍內(nèi), EGB 的這種藥理作用呈劑量依賴性增強(qiáng)。Chop in 等[ 6 ]對(duì)A lzheim er 病引起的記憶功能失調(diào)的小鼠模型, 給予EGB 150～ 500 m gö kg, 能明顯減弱遺忘作用。另有類(lèi)似研究指出EGB 呈劑量依賴性提高正常大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[ 7 ]。近年來(lái)有關(guān)EGB 的臨床療效觀察也發(fā)現(xiàn) EGB 可明顯改善血管性癡呆患者的智能障礙, 這種作用可能與EGB 加速神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo), 易化突觸傳遞, 從而有利于信息獲得、記憶鞏固和再現(xiàn)有關(guān)[4,8]。由此可見(jiàn), EGB 是一類(lèi)作用廣泛、療效肯定的益智藥, 具備較好的臨床應(yīng)用前景。

研究顯示, 海馬區(qū)蛋白質(zhì)合成率的高低與學(xué)習(xí)記憶有密切關(guān)系[9], 另有研究發(fā)現(xiàn)東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙的機(jī)制可能是由于東莨菪堿抑制了腦內(nèi)尤其海馬區(qū)突觸體蛋白質(zhì)的合成, 影響神經(jīng)信息的突觸傳遞, 導(dǎo)致大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力受到影響[1]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠海馬區(qū)蛋白質(zhì)較正常老齡對(duì)照組顯著降低,與上述結(jié)論相符, 也進(jìn)一步說(shuō)明本造模法經(jīng)改進(jìn)后仍穩(wěn)定可靠。本實(shí)驗(yàn)還表明, EGB與其它益智藥不同,它并未明顯增加癡呆大鼠海馬區(qū)業(yè)已降低的蛋白質(zhì)含量, 故對(duì)蛋白質(zhì)合成的促進(jìn)作用可能不是EGB的益智作用機(jī)制。

中樞膽堿能系統(tǒng)的海馬膽堿能投射纖維及基底前腦膽堿能細(xì)胞的功能障礙是導(dǎo)致各種類(lèi)型癡呆動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力下降的重要原因, 這一研究成果為探討動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶病理生理機(jī)制建立了一定的形態(tài)學(xué)和物質(zhì)基礎(chǔ)。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EGB 能明顯提高老齡癡呆鼠海馬腦區(qū)的A ch 含量, 且這種促進(jìn)作用也呈劑量依賴性關(guān)系, 據(jù)此推測(cè), EGB 可能通過(guò)增加學(xué)習(xí)記憶功能腦區(qū)的A ch 含量而改善癡呆動(dòng)物的智能障礙。為了更深入全面地認(rèn)識(shí)EGB 對(duì)老年性癡呆的益智機(jī)理, 尚待開(kāi)展多模型、多劑型、多時(shí)程、多指標(biāo)的系統(tǒng)研究。