RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理、材料和操作步驟

學(xué)習(xí)RNA瓊脂糖凝膠電泳的使用技術(shù)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

RNA可以使用非變性或變性凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。在非變性電泳中，可以分離混合物中不同分子量的RNA分子，凡是無(wú)法確定分子量。只有在變性情況下，RNA分子完全伸展，其泳動(dòng)率才與分子量成正比。

判斷RNA提取物的完整性是進(jìn)行電泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的電泳圖譜應(yīng)可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三條帶，且28s rRNA的亮度應(yīng)為18s rRNA的兩倍。

三、材料、試劑及器具

1、 材料

總RNA提取物。

2、 試劑

（1）0.1%DEPC水：200ml雙蒸去離子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混勻，室溫放置過(guò)夜，高壓滅菌。

（2）10x電泳緩沖液。

嗎啉代丙烷磺酸（MOPS） 0.4mol/L（pH 7.0）

NaAc 0.1mol/L

乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L

（3）50mL變性瓊脂糖凝膠（1%）

（4）10x電泳緩沖液 5 mL

瓊脂糖 0.5 g

0.1%DEPC水 36.5 mL

加熱溶解，稍冷卻，加入8.5 mL 37%甲醛。

（5）上樣緩沖液：50%甘油，1mmmol/LEDTA，0.4% 溴酚蘭，0.4%二甲苯藍(lán)。

（6）甲酰胺（去離子）。

3、器具

（1）電泳系統(tǒng)

（2）紫外透視儀

四、操作步驟

1、 將制膠用具用70%乙醇沖洗一遍，晾干備用。

2、 制膠：

稱取0.5g瓊脂糖粉末，加入放有36.5mL的DEPC水的錐形瓶中，加熱使瓊脂糖完全溶解。稍冷卻后加入5mL的10x電泳緩沖液、8.5mL的甲醛。然后在膠槽中灌制凝膠，插好梳子，水平放置待凝固后使用。

3、 加樣：

在一個(gè)潔凈的小離心管中混合以下試劑：電泳緩沖液（10x）2μl、甲醛3.5mL、甲酰胺10mL、RNA樣品3.5μl�；靹颍�置60℃保溫10min，冰上速冷。加入3μl的上樣緩沖液混勻，取適量加樣于凝膠點(diǎn)樣孔內(nèi)。同時(shí)點(diǎn)RNA標(biāo)準(zhǔn)樣品。

4、 電泳：

打開(kāi)電泳儀，穩(wěn)壓7.5V/cm電泳。

5、 電泳結(jié)束后通過(guò)紫外透視儀觀察。

五、注意事項(xiàng)

本實(shí)驗(yàn)中必須保持RNase污染以免RNA降解。所有試劑用DEPC水配制，用具也用DEPC水沖洗，并滅菌。