PCR技術(shù)專題：PCR-SSP分析實(shí)驗(yàn)原理和步驟

PCR 序列特異性引物（sequence specific primer,SSP）分析法是使用能夠特異識(shí)別特定等位基因的引物通過PCR擴(kuò)增檢測(cè)序列多態(tài)性的方法，也稱作等位基因特異性引物PCR 法。本實(shí)驗(yàn)是應(yīng)用PCR-SSP 法檢測(cè)MN 基因型。

[實(shí)驗(yàn)原理]

根據(jù)決定某等位基因的堿基性質(zhì)，設(shè)計(jì)3′端第一個(gè)堿基分別與各等位基因的特異性堿基相匹配的序列特異性引物，在PCR反應(yīng)過程中，只有引物3′端第一個(gè)堿基與決定特定等位基因的堿基互補(bǔ)時(shí)才能實(shí)現(xiàn)DNA 片段的完全復(fù)制，根據(jù)PCR 產(chǎn)物的有無進(jìn)行等位基因的分型。

[實(shí)驗(yàn)器材]

PCR 擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽。

[實(shí)驗(yàn)試劑]

引物1：5′-GCATCAAGTACCACTGGT-3′；引物2：5′-GCATTAAGTACCACTGAG-3′；共通引物：5′-GAGAAGTTGAGAAAGGGGT-3′。模板DNA、Taq 聚合酶、、電極緩沖液、上樣緩沖液等

[實(shí)驗(yàn)方法]

1.PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20μl（2個(gè)體系，分別為引物1和引物2），含模板2μl(約50ng)，引物各1.5μl,dNTP1.6μl(0.4mM)，10×Buffer緩沖液2μl，Taq酶1.0U，加雙蒸水至20.0μl；PCR反應(yīng)條件為94℃4min,94℃1.5min/52℃2.0min/72℃2.0min，30個(gè)循環(huán)。

2.PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2μl，6%聚凝膠電泳（T=6%，C=3.3%，凝膠規(guī)格為82mm×64mm×0.75mm）。電極緩沖液為1×TBE。將加有1/5體積上樣緩沖液的酶切產(chǎn)物電泳，220 v 電壓，電泳2－3h。銀染顯色

[結(jié)果判定]

根據(jù)電泳譜帶的有無判定等位基因型別，僅有1 個(gè)體系檢測(cè)到譜帶者為相應(yīng)特異性引物對(duì)應(yīng)型（M 或N），2 個(gè)體系均檢測(cè)到譜帶者為MN 型。

[實(shí)驗(yàn)討論]

1.注意事項(xiàng) ①如引物結(jié)合序列存在堿基變異可能無擴(kuò)增產(chǎn)物，導(dǎo)致錯(cuò)誤判型；②在對(duì)照樣品分型準(zhǔn)確的基礎(chǔ)上才能判定結(jié)果。

2.方法評(píng)價(jià) 該方法操作簡(jiǎn)單，引物設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)的復(fù)性條件要求較高。