蛋白質(zhì)技術(shù)專題：血紅蛋白電泳（hemoglobin electrophoresis）

實(shí)驗(yàn)原理

血紅蛋白電泳（hemoglobin electrophoresis）目的是檢出和確認(rèn)各種正常和異常的血紅蛋白。

根據(jù)不同的血紅蛋白帶有不同的電荷，等電點(diǎn)不同，在一定的pH緩沖液中，血紅蛋白的等電點(diǎn)小于緩沖液的pH時(shí)帶負(fù)電荷，電泳時(shí)在電場(chǎng)中向陽(yáng)極泳動(dòng)，反之，Hb帶正電荷向陰極泳動(dòng)。在一定電壓下，經(jīng)過一定時(shí)間的電泳，不同的血紅蛋白所帶電荷不同，分子量不同，其泳動(dòng)方向和速度不同，可分離出各自的區(qū)帶，同時(shí)對(duì)電泳出的各區(qū)帶進(jìn)行比色或電泳掃描，可進(jìn)行各種血紅蛋白的定量分析。一般最常用的是pH8.6醋酸纖維薄膜電泳。

胞漿內(nèi)存在糖原或多糖類物質(zhì)（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）經(jīng)過碘酸（periodicacid）氧化，轉(zhuǎn)變?yōu)槎�醛基（CHO-CHO），與雪夫(Schiff )試劑中的無色品紅結(jié)合，形成紫紅色染料而沉積于細(xì)胞內(nèi)多糖所在處。該反應(yīng)稱為過碘酸-雪夫(PAS)陽(yáng)性反應(yīng)，以前也稱為糖原染色。

實(shí)驗(yàn)方法

材料：

1. 緩沖液

（1）pH8.6 TEB緩沖液：稱取Tris10.29 g，EDTA 0.6 g，硼酸3.2 g，加蒸餾水至1000 ml。

（2）硼酸鹽緩沖液：稱取硼砂6.87 g，硼酸5.56 g，加蒸餾水至1000 ml。

2. 醋酸纖維薄膜、電泳儀、加樣器、分光光度計(jì)、比色杯。

方法：

1. 血紅蛋白溶液的制備

取肝素或者枸櫞酸鈉抗凝血3 ml，2000 rpm離心10分鐘后棄去血漿；用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞三次（750 rpm，離心5分鐘），再2200rpm，離心10分鐘，棄去上清液；加入等量的蒸餾水；再加入0.5倍體積四氯化碳，用力振搖5分鐘，2200 rpm，離心10分鐘后將上層Hb液吸出備用。

2. 浸膜

將醋酸纖維薄膜剪成3 cm×8 cm的紙條，浸入pH8.6 TEB緩沖液，浸透后取出，用濾紙吸干。

3. 點(diǎn)樣

用加樣器取血紅蛋白液10 μl，然后垂直點(diǎn)樣到醋酸纖維膜上（毛面），距邊緣1.5 cm處。

4. 電泳

將硼酸鹽緩沖液作為電泳緩沖液倒入電泳槽中，將點(diǎn)樣后的醋酸纖維膜放于電泳槽架上，點(diǎn)樣在陰極端，200 V，30分鐘。

5. 洗脫

分別剪下HbA、HbA2，放入試管內(nèi)，分別加入蒸餾水15 ml和3 ml，輕輕振蕩，待血紅蛋白完全洗脫后，混勻。

6. 比色

洗脫液用蒸餾水空白調(diào)零，415 nm測(cè)定吸光度。

7. 計(jì)算

HbA2(%)=HbA2管吸光度/（HbA管吸光度×5+ HbA2管吸光度）×100%

實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算

pH8.6 TEB緩沖液醋酸纖維電泳參考范圍：HbA>95%，HbA2 1%-3.1%

注意事項(xiàng)

1. 電泳時(shí)間不能太長(zhǎng),電泳時(shí)醋纖膜不能變干,故應(yīng)觀察到HbA和HbA2清晰分開就停止電泳,電泳時(shí)間太長(zhǎng)區(qū)帶反而擴(kuò)散模糊；

2. 點(diǎn)樣量不能太多,如血紅蛋白液太多，色帶易脫落或染色不透，可出現(xiàn)HbA相對(duì)增高的假陽(yáng)性結(jié)果；

3. 避免醋酸纖維膜被蛋白質(zhì)污染；

4．電流不應(yīng)過大，否則血紅蛋白分不開帶；

5．應(yīng)同時(shí)做正常人和必要的已知異常血紅蛋白的標(biāo)本對(duì)照。