細胞技術專題：大鼠胰島細胞培養(yǎng)實驗
實驗方法原理
水合氯醛腹腔麻醉，采用膠原酶ⅴ逆行灌注、原位消化及Ficoll-400梯度離心的方法分離、純化大鼠胰島，并分離、培養(yǎng)胰島單細胞。
實驗材料 一周齡Wistar 大鼠
試劑、試劑盒 D-Hanks’液 胰蛋白酶 Ⅴ型膠原酶 葡萄糖 碘乙酸
儀器、耗材 手術剪 手術鉗 眼科剪刀 眼科鑷子 大頭針 手術刀片 培養(yǎng)皿
實驗步驟
一、實驗步驟
1. 一周齡Wistar大鼠，斷頸處死，于75%乙醇浸泡15 分鐘，無菌取出胰腺，于冰冷無菌D-Hanks’液中漂洗，用眼科剪仔細清除脂肪、包膜、血管等胰外組織，轉入青霉素小瓶中。
2. 加入少量無菌D-Hanks’液，用眼科剪剪成0.1-1.0 mm3 大小的碎片，用滴管輕輕吸出上層細小脂肪碎塊和油滴，再用無菌D-Hanks’液反復清洗 8~10 次，加入10 倍體積無菌消化酶液[胰蛋白酶-膠原酶消化液：0.05 g 胰蛋白酶，0.025 g Ⅴ型膠原酶(663 U/mg)，0.05 g 葡萄糖，溶于100mL 無Ca2+、Mg2+的0.01 mol/L PBS(pH 值為 7.4)溶液，用0.22 µm 微孔濾膜濾菌]，38℃±1℃消化，消化過程中不斷震蕩，10 分鐘后棄去上清液。
3. 用無菌D-Hanks’液將組織塊清洗 2~3 次，加入新鮮酶液繼續(xù)消化，重復上述步驟，此時組織塊邊緣模糊。
4. 將組織塊浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10 分鐘，將消化酶液與組織塊分開，組織塊重新加入新鮮消化酶液進行消化；而原消化酶液1500 rpm離心 10 分鐘，取沉淀即為消化下的細胞，重新用無菌D-Hanks’懸浮，離心，重復 1~2 次，再用培養(yǎng)基洗 2~3 次，用培養(yǎng)基懸浮即得細胞懸液。
5. 將消化過的組織塊重復消化5~6 次至組織塊消化完全，重復以上操作。
6. 合并幾次所得細胞懸液，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為 2×105個細胞/mL，將細胞懸液接種于24 孔塑料培養(yǎng)板中，每孔1 mL，置于37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
7. 由于成纖維細胞貼壁要比胰島細胞迅速，接種15 h 后，輕輕振蕩培養(yǎng)板，將上面未貼壁的細胞接入新的培養(yǎng)板中，可除去部分成纖維細胞。
8. 將新培養(yǎng)板中細胞培養(yǎng) 48 小時后，換新鮮配置的含有2.5 ng/mL 的碘乙酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)5 h，可除去絕大部分成纖維細胞，而胰島細胞不受傷害，換不含碘乙酸的培養(yǎng)基洗2 次，并換不含碘乙酸的培養(yǎng)基在 37℃、5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔 3 天換培養(yǎng)液，獲得單層胰島細胞。
