細(xì)胞技術(shù)專題：腫瘤細(xì)胞的軟瓊脂集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

在體外培養(yǎng)基中由一個祖先細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞團(tuán)，稱之為集落。腫瘤細(xì)胞能無限繁殖，所以具有這種能力，而成熟分化的細(xì)胞則不能形成集落。

實(shí)驗(yàn)方法
基本方案
實(shí)驗(yàn)方法原理 HL-60細(xì)胞是一種急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞，在體外無需加刺激因子，可在軟瓊脂培養(yǎng)基中形成集落。二甲基亞砜是一種細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，經(jīng)二甲基亞砜處理后的HL-60細(xì)胞按粒系途徑定向成熟分化，同時細(xì)胞的增殖力降低，幾乎全部細(xì)胞喪失了軟瓊脂中形成集落的能力。因此，這種方法可用于細(xì)胞分化的基礎(chǔ)研究和臨床腫瘤治療的療效檢驗(yàn)等方面。 
實(shí)驗(yàn)材料 HL-60細(xì)胞 
試劑、試劑盒 小牛血清 RPMI1640培養(yǎng)液 臺盼蘭 瓊脂 二甲基亞砜 
儀器、耗材 超凈工作臺 二氧化碳培養(yǎng)箱 顯微鏡 培養(yǎng)瓶 吸管 酒精燈 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 多孔培養(yǎng)板 
實(shí)驗(yàn)步驟 1.  收集對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞，先按實(shí)驗(yàn)十三測定細(xì)胞活力，然后調(diào)整細(xì)胞濃度，制成300~1 000活細(xì)胞/ml 的細(xì)胞懸液。

2.  取二個培養(yǎng)瓶每個瓶中加9 ml 調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液，然后各加入1 ml 3%瓊脂（已融化，在65℃水浴中放置），迅速加入，混勻。

3.  用微量加樣器吸140 μl 二甲基亞砜（MDSO），加到一個瓶中，充分混勻，為實(shí)驗(yàn)組，另一瓶不加DMSO，為空白對照組。

4.  取一個16 mm 多孔培養(yǎng)板，每孔加1 ml（35 mm 培養(yǎng)皿需加2 ml）細(xì)胞瓊脂懸液，勿有氣泡，將實(shí)驗(yàn)組和對照組分兩組加好，蓋上蓋并作好標(biāo)記。

5.  在室溫放置20分鐘使細(xì)胞瓊脂懸液凝固。

6.  然后移培養(yǎng)板或平皿于CO2培養(yǎng)箱中37℃進(jìn)行培養(yǎng)。

7.  培養(yǎng)7~10天，肉眼觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞集落。

8.  結(jié)果：以肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)（含500個以上細(xì)胞）作為計(jì)數(shù)集落的標(biāo)準(zhǔn)。對照組HL-60細(xì)胞在含0.3%的軟瓊脂培養(yǎng)基中生長良好，每個孔中可見有多個集落形成，而實(shí)驗(yàn)組HL-60細(xì)胞因經(jīng)二甲基亞砜誘導(dǎo)分化，細(xì)胞在軟瓊脂中的集落形成明顯減少。

9.  集落的計(jì)數(shù)和計(jì)算：

（1）集落數(shù)=n孔中細(xì)胞集落數(shù)總和/n孔

（2）集落形成率=集落數(shù)/接種培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)×100%