細(xì)胞技術(shù)專題：兔膀胱平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

（1）肌注鹽酸氯胺酮200 mg 及氟哌利多5 mg 麻醉，待兔進(jìn)入麻醉狀態(tài)后消毒，下腹正中切口，迅速切取膀胱組織。

 

（2）超凈臺(tái)內(nèi)依次慶大霉素溶液(濃度為100 單位/毫升)、生理鹽水及D-Hanks’液中浸泡洗滌 5 分鐘，然后放入D-Hanks液中除去黏膜、黏膜下及漿膜層。

 

（3）肌肉剪成肉糜后0.1%Ⅱ型膠原酶(2 mg/mL) 溶液 40 過夜消化(約10-12 小時(shí))。

 

（4）然后加 0.25%胰蛋白酶 370 消化30 分鐘，消化液變混濁呈絮狀提示消化良好。

 

（5）用100 目細(xì)胞篩過濾該絮狀液，混懸液離心(1000  轉(zhuǎn)/分，離心半徑 13 cm) 5 分鐘，沉淀的細(xì)胞移入培養(yǎng)皿，加入含 10%胎牛血清的DMEM，置于50 mL/L CO₂、37℃飽和濕度孵育箱中靜置培養(yǎng)， 培養(yǎng)液每周更換 2-3 次。

（1）待培養(yǎng)的細(xì)胞通過增殖達(dá)到約 80%匯合狀態(tài)時(shí)做傳代處理。

 

（2）棄去原培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，加入適量 的PBS(因培養(yǎng)液中的胎牛血清對(duì)胰蛋白酶有抑制作用)，輕輕搖動(dòng)，清洗殘留的培養(yǎng)液后棄之。

 

（3）加入適量的消化液，使其覆蓋整個(gè)細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶放置于CO₂培養(yǎng)箱，不時(shí)在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞胞質(zhì)回 縮，胞間間隙增大后，吸出消化液，并向培養(yǎng)瓶中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。

 

（4）用吸管吸取培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁制備細(xì)胞懸液，吹打時(shí)不能用力過猛，盡量不出現(xiàn)氣泡，以免損傷細(xì)胞。

 

（5）細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后，按照 1X10⁵~10⁶細(xì)胞/mL 密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中。

兩只兔所有標(biāo)本均獲成功。倒置顯微鏡觀察平滑肌細(xì)胞24 小時(shí)均可見膀胱平滑肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，正常兔 7 天左右、而梗阻兔則需10~12 天可于50 毫升培養(yǎng)瓶約 80%匯合。

均傳代順利，傳代后約正常兔6天左右、而梗阻兔需8~9 天可于50 毫升培養(yǎng)瓶約 80%匯合。

本組中均傳至第8 代，經(jīng)第8 次傳代后， 平滑肌細(xì)胞仍生長(zhǎng)迅速，未見衰老跡象。

倒置顯微鏡下觀察均呈“谷和峰”樣結(jié)構(gòu)(圖1 中對(duì)照組2 周的 細(xì)胞；圖2 中實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)2 周的細(xì)胞)。

細(xì)胞爬片HE染色見膀胱平滑肌細(xì)胞細(xì)胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細(xì)胞核型(見圖 3)。

電鏡檢查可見平滑肌細(xì)胞密班結(jié)構(gòu)(圖 4)。

免疫組化染色檢測(cè)α-SMA 呈陽性反應(yīng)(圖 5)。

從細(xì)胞爬片HE染色和免疫組化染色檢測(cè)α-SMA 呈陽性反應(yīng)中我們發(fā)現(xiàn)該方法所的膀胱平滑肌細(xì)胞的純度幾乎99%。