細胞技術(shù)專題：小鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)實驗
小鼠腹腔巨噬細胞培可以：（1）吞噬與清除異物；（2）分泌生物活性物質(zhì)；（3）對仿生全降解材料，降解后的無機產(chǎn)物與生命過程中有機物的合成作用。
實驗方法
- 細胞培養(yǎng)技術(shù)
| 實驗方法原理 | 取小鼠腹腔巨噬細胞與乳膠顆粒在不同培養(yǎng)條件下混合后定量加入24孔板，37 ℃，5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育后，熒光顯微鏡下計數(shù)吞噬百分率和吞噬指數(shù)。 |
|---|---|
| 實驗材料 |
小鼠 |
| 試劑、試劑盒 |
1640 培養(yǎng)基 小牛血清 雙抗 臺盼蘭 |
| 儀器、耗材 |
手術(shù)器械 一次性注射器 眼科鑷 眼科剪 96 孔板 CO2培養(yǎng)箱 |
| 實驗步驟 |
一、實驗步驟
1. 如果采用刺激物，則可在實驗前三天腹腔注射3%巰基乙醇酸鈉每只2 mL，獲得的巨噬細胞數(shù)要多一些。不采用刺激物，直接開始下面的步驟。
2. 拉頸處死小鼠，在75%酒精浸泡1-2 分鐘，移入超凈臺中，仰臥位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮膚，酒精綿球脫碘。用手術(shù)直剪充分剪開腹部皮膚，暴露腹部肌層，再用酒精綿球消毒腹部肌層。
3. 用注射器抽取5mL 含雙抗的RPMI 1640 培養(yǎng)基注入腹腔，用綿球輕揉腹部1-2 min，然后，用眼科鑷稍提起腹腔，并用眼科剪剪開一個小口，用吸管吸取細胞懸液，移入離心管中(個人認為，此法比用注射器抽吸好一些)。
4. 1000 rpm 離心5 min 后，用含雙抗的RPMI 1640 培養(yǎng)基洗滌一次，再次離心，重懸細胞于含10% 小牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，如果是作為飼養(yǎng)細胞使用，則選擇相應(yīng)的培養(yǎng)液。臺盼藍拒染法計數(shù)，將細胞稀釋到目的濃度后，接種即可。
5. 如果是作為飼養(yǎng)細胞使用，調(diào)整濃度至2x105個/mL，接種到96 孔板中，每孔100-200 µL；如 果作為其它實驗使用，可以調(diào)整成2x106/mL，加到 24 孔平底培養(yǎng)板中，1 mL/孔；5% CO2溫箱孵育2 h 后， 換液，并用RPMI 1640 培養(yǎng)基洗1-2 次，棄去未粘附細胞，貼壁細胞為單層的巨噬細胞。 二、結(jié)果 巨噬細胞剛貼壁時偏圓形，或者類似鵝卵石形狀，然后慢慢伸出偽足，鋪開呈三角形或多角形。巨噬細胞有吞噬的特性，當與細菌混合在一起的時候，在40 倍物鏡下可以看到巨噬細胞吞噬細菌，因此，巨噬細胞作為飼養(yǎng)細胞可以清除部分污染的細菌、支原體和部分細胞碎片。 |
| 注意事項 |
注意事項：嚴格無菌操作，在超凈臺內(nèi)進行；為避免交叉感染，每一只小鼠更換注射器；吸管吸取細胞懸液的時候，盡量不要吸到大小腸，否則容易引起成纖維細胞污染。
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| 其他 |
一、討論 巨噬細胞一般沒有特殊的鑒定方法，有兩條經(jīng)驗： 1. 巨噬細胞是終末分化細胞，不會增殖 2. 很難消化下來，所以接種的時候，必須直接接種到目的培養(yǎng)器皿中。 |
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