聚焦微生物研究-（系列二）

活菌 PCR 是一項(xiàng)嶄新的技術(shù)，能夠選擇性地?cái)U(kuò)增存活細(xì)胞的 DNA。這使得研究人員能夠快速、可靠地區(qū)分存活和死亡細(xì)胞，而不再依賴耗時(shí)的培養(yǎng)方法進(jìn)行判斷。

傳統(tǒng) PCR 法的一個(gè)主要缺點(diǎn)就是無法分辨存活和死亡的微生物。這會(huì)導(dǎo)致誤導(dǎo)性結(jié)果的生成，例如高估污染水平。此外僅對(duì)于存活微生物，傳統(tǒng)方法也無法勝任精確的定量檢測工作（圖 3）

PMA 選擇性地進(jìn)入死亡細(xì)胞，由光激活進(jìn)而嵌入 DNA 并與之共價(jià)結(jié)合，從而在后續(xù) PCR 中強(qiáng)烈抑制擴(kuò)增反應(yīng)。由死亡細(xì)胞 DNA 獲得的 CT 信號(hào)顯著高于存活 DNA，據(jù)此實(shí)現(xiàn)存活和死亡細(xì)胞的明確區(qū)分（圖 4）。

圖 4. PMA 抑制了死亡細(xì)胞 DNA 的擴(kuò)增反應(yīng)。使用緩沖蛋白胨水配制多種濃度的死亡沙門氏菌樣本，并制備了 PMA處理組樣本和非處理組樣本。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) PMA 處理組的 CT值相比未處理組發(fā)生了明顯的上移，ΔCT 平均值為 11.4 左右。這表明 PMA 抑制了死亡沙門氏菌 DNA 的進(jìn)一步擴(kuò)增。在沙門氏菌 PMA 處理組中未見到像非處理組那樣的 CT 值滴定效應(yīng)，這可能是由于樣本中較低的拷貝數(shù)范圍處于所使用的 mericon Salmonella spp Kit 的檢測下限所致。

當(dāng)使用存活和死亡微生物的混合樣本時(shí)，PMA 可選擇性地抑制對(duì)死亡細(xì)胞的檢測，而不會(huì)對(duì)存活細(xì)胞 DNA 的檢測造成影響（圖 5）。樣本中的死亡細(xì)胞不會(huì)影響 PMA 的性能。因此可確信，所得到的結(jié)果能夠精確反映樣本中的存活微生物。

圖 5. 在存活和死亡細(xì)胞的混合樣本中，死亡細(xì)胞 DNA 的檢測仍選擇性地受到抑制。左側(cè)的柱狀圖代表了緩沖蛋白胨水中的存活沙門氏菌細(xì)胞。右側(cè)的柱狀圖則相應(yīng)代表了以10:90%、50:50%、90:10% 和 100:0% 等不同比例混合的存活與熱滅活（死亡）沙門氏菌樣本。結(jié)果證明兩組的 CT值之間存在高度的一致性（CT 值變異度低于 1）。這就印證了 PMA 可有效抑制死亡沙門氏菌檢測，也說明 PMA 能夠針對(duì)存活和死亡細(xì)菌的混合樣本提供高水平的分辨能力。

PMA 所具有的存活和死亡細(xì)胞分辨能力，能確保您可以輕松、絕對(duì)肯定地衡量自身滅菌控制措施的有效性。比較存活和死亡沙門氏菌混合樣本的 PMA 處理組與未處理組 CT 值差異（ΔCT）時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，較高 CT值的最大信號(hào)位移可達(dá) 15 左右。這一顯著性的信號(hào)分離事件可用于明確區(qū)分 PMA 結(jié)合的死亡細(xì)胞 DNA 與 PMA 未結(jié)合的存活細(xì)胞 DNA。而這一分辨能力在樣本中存活細(xì)胞比例變化較小的情況下仍然有效。這將確保您可以輕松并絕對(duì)、肯定地衡量自身滅菌控制措施的有效性。

圖 6. PMA 提供了高效的存活和死亡細(xì)胞區(qū)分能力。這里顯示了在存活和死亡沙門氏菌混合樣本中 PMA 處理與非處理組之間 CT 值的差異。包含 100% 死亡沙門氏菌的樣本在PMA 處理?xiàng)l件下，相比未處理組發(fā)生了幅度為 15 左右的CT 值上移。PMA 介導(dǎo)的信號(hào)淬滅效應(yīng)是非線性的，在存活細(xì)胞的檢測中它將顯著增加，并因此導(dǎo)致 CT 值相對(duì)未處理組發(fā)生大幅降低，進(jìn)而增大了全局性的分辨敏感度。

使用光激活化合物時(shí)存在的一個(gè)問題是，如何在性能不夠理想的渾濁介質(zhì)中實(shí)現(xiàn)細(xì)胞活性檢測。好在，激活 PMA 所使用的波長能夠穿透渾濁介質(zhì)。

我們?cè)谝豁?xiàng)針對(duì)李斯特菌的分析配置中加入了對(duì)照 DNA（摻入（spiked-in）DNA），以確保 PMA 試劑的效能和實(shí)現(xiàn)正確操作。PMA 處理組與非處理組樣本之間對(duì)照 DNA CT 值的比較結(jié)果可用來證實(shí) PMA 試劑的效能及操作的正確性。圖 7 顯示了 PMA 存活 / 死亡細(xì)胞區(qū)分流程的檢測結(jié)果，這些結(jié)果中包含了對(duì)熱滅活與存活李斯特菌混合樣本中靶標(biāo)通道和對(duì)照 DNA（對(duì)照通道）的檢測。在靶標(biāo)通道中，存活李斯特菌樣本PMA 處理組與非處理組之間 CT 值不存在差異，這與實(shí)驗(yàn)預(yù)期一致。在死亡李斯特菌樣本中引入 PMA 處理會(huì)導(dǎo)致 CT 結(jié)果值出現(xiàn)預(yù)期性上升，這是 PMA 成功嵌入 DNA 的后續(xù)結(jié)果（圖 7A）。在對(duì)照通道中，摻入到李斯特菌樣本中的 DNA 顯示了預(yù)期為 6 左右的的 CT 值移動(dòng)，其移動(dòng)范圍仍處于特定的 6±2 區(qū)間內(nèi)，說明該結(jié)果并未受到所使用的 Nutella®介質(zhì)影響（圖 7B）。

這些數(shù)據(jù)清晰證明了 PMA 的激活光強(qiáng)足以穿透混濁樣品，并能成功介導(dǎo) DNA 的嵌入反應(yīng)。

圖 7. 勻質(zhì)介質(zhì)對(duì) PMA 存活 / 死亡細(xì)胞區(qū)分能力的影響。nA 將存活或熱滅活的李斯特菌摻入2.5% Nutella 基質(zhì)中，并單獨(dú)進(jìn)行處理。存活李斯特菌在 PMA 處理組與非處理組之間未顯示 CT 值改變。死亡李斯特菌樣本的 PMA 處理組顯示了預(yù)期中的 CT 信號(hào)位移，表明對(duì) DNA成功完成了嵌入性修飾。nB 將對(duì)照 DNA 加入含有相同 2.5% Nutella 基質(zhì)的存活或死亡細(xì)胞樣本中。存活或死亡細(xì)胞的背景未對(duì)對(duì)照 DNA 的檢測造成顯著影響，這些檢測結(jié)果中僅對(duì)應(yīng)體現(xiàn) PMA 的存在與否。6 左右的 CT 值移動(dòng)仍就存在，并符合預(yù)定 6±2 的變動(dòng)范圍。這些數(shù)據(jù)提示了該應(yīng)用中的 PMA 激活光強(qiáng)足以穿透混濁樣品，并能成功介導(dǎo) DNA 的嵌入反應(yīng)。

以上信息來源于QIAGEN官網(wǎng)！