蛋白質(zhì)濃度測定（雙縮脲法）實(shí)驗(yàn)介紹

實(shí)驗(yàn)原理

測定蛋白質(zhì)的定量方法有很多，目前常用的有凱氏定氮法；比色法主要包括雙縮脲法、Folin-酚試劑法及 染料結(jié)合法；紫外分光光度法等

雙縮脲(Biuret)法：在堿性溶液中，雙縮脲(H2N—CO—NH—CO—NH2)與二價(jià)銅離子作用形成紫紅色的絡(luò)合物，這一反應(yīng)稱雙縮脲反應(yīng)。凡分子中含二個(gè)或二個(gè)以上酰胺基(—CO—NH2)，或與此相似的基團(tuán)[如—CH2—NH2，—CS—NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，無論這類基團(tuán)直接相連還是通過一個(gè)碳或氮原子間接相連，均可發(fā)生上述反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子含有眾多肽鍵(—CO—NH—)，可發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，且呈色強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)與肽鍵數(shù)量即與蛋白質(zhì)含量成正比，可用比色法測定蛋白含量。與同樣處理的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液比較，經(jīng)計(jì)算或查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出血清總蛋白質(zhì)含量。

實(shí)驗(yàn)試劑

1．6mol/L氫氧化鈉溶液  
稱取氫氧化鈉(NaOH，優(yōu)級(jí)純)240g，用新鮮蒸餾水配制成1L，置室溫貯存在密封的聚乙烯瓶里。
2．雙縮脲試劑  
稱取未失結(jié)晶水的硫酸銅(CuSQ·5H20) 3.0g，溶于500m1新鮮蒸餾水中，加酒石酸鉀鈉(NaKC₄H₄O₆.4H₂O)9.0g，碘化鉀(KI)5.0g，待安全
溶解后，加入6mol/L氫氧化鈉溶液100ml，最后加蒸餾水至1L。室溫貯存在密閉的聚乙烯瓶里，約穩(wěn)定6個(gè)月。
3．蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 
可用商品血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或定值質(zhì)控血清為標(biāo)準(zhǔn)。亦可收集混合新鮮血清，用凱氏定氮法標(biāo)定后，加疊氮鈉防腐(疊氮鈉的終濃0.5~1.0g/L)，冰凍
保存。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

恒溫水浴箱、722（721）分光光度計(jì)、吸管、試管、坐標(biāo)紙

實(shí)驗(yàn)步驟

1.   配制20g／L蛋白標(biāo)準(zhǔn)液  如蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為70g／L，則取此液2m1，加入新鮮蒸餾水5ml，混勻即成。

2.   按表操作

混勻，置37℃水浴10min(或25℃30min)，用540nm波長比色，以空白管調(diào)零，讀取各管吸光度。

3.   標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
1—5為標(biāo)準(zhǔn)曲線管，測得吸光度后，以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.   實(shí)驗(yàn)結(jié)果
根據(jù)測定管吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查找相對(duì)應(yīng)的總蛋白濃度。 

注意事項(xiàng)

1．雙縮脲試劑中，加入酒石酸鉀鈉，Cu2 形成穩(wěn)定的絡(luò)合銅離子，以防止CuSO4·5H20不穩(wěn)定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸鉀鈉與CuSO4·5H20之比
      不低于3：1，加入KI作為抗氧化試劑。

2．雙縮脲試劑要封閉貯存．防止吸收空氣中的二氧化碳。

3．本法各種蛋白質(zhì)的顯色程度基本相同，重復(fù)性好，幾乎不受溫度影響，唯一缺點(diǎn)是靈敏度較低。

4．黃疸血清．嚴(yán)重溶血對(duì)本法有明顯干擾。