基于量子點的單分子熒光示蹤技術(shù)揭示分子馬達的行走機制

在生物體內(nèi)，分子馬達參與肌肉收縮、胞質(zhì)運輸、DNA轉(zhuǎn)錄以及有絲分裂等一系列重要的生命活動。在執(zhí)行上述功能過程中，分子馬達需要借助ATP水解釋放的能量，完成在細胞骨架上的特定運行軌跡。因此，關(guān)于分子馬達沿著細胞骨架的行走機制的研究，對于深刻認識分子馬達的作用機制，以及相關(guān)疾病的診斷和治療具有重要意義。美國霍華德·休斯醫(yī)學研究所的Ronald D. Vale課題組，應(yīng)用單分子熒光標記與示蹤技術(shù)，揭示了分子馬達之一——動力蛋白（Dynein）在微管骨架上的行走特性（圖1）。

Ronald D. Vale等構(gòu)建了動力蛋白與HaloTag的融合蛋白表達載體，經(jīng)出芽酵母表達，向純化的融合蛋白加入HaloTag生物素配基，獲得生物素化的動力蛋白。為了與鏈霉親合素偶聯(lián)的量子點（Streptavidin-Quantum dots, SA-QDs）進行標記，將生物素化的動力蛋白置于體外反應(yīng)池，首先在沒有ATP的條件下與軸絲（axonemes）結(jié)合，再與SA-QDs孵育。經(jīng)過上述反應(yīng)，動力蛋白被量子點標記，同時可避免由SA-QDs引發(fā)的動力蛋白聚集。

研究人員利用上述量子點標記的動力蛋白，應(yīng)用高敏感性和高分辨率的熒光成像技術(shù)，分析了動力蛋白在微管骨架上的步進行為特性（圖2）。量子點的高熒光亮度和耐光漂白特性，可以滿足精確示蹤的要求；同時，量子點的高熒光穩(wěn)定性使示蹤時程可持續(xù)數(shù)分鐘。數(shù)據(jù)分析顯示，對動力蛋白頭部和尾部進行的量子點標記，對其步進功能沒有干擾。總之，上述單分子熒光標記與示蹤技術(shù)，從分子水平揭示了馬達蛋白的行為特性，豐富了分子馬達的基礎(chǔ)理論研究，相關(guān)成果發(fā)表于《CELL》。

圖1動力蛋白在微管骨架上的行走模式圖（Spudich JA, Cell 2006）

圖2 量子點標記的動力蛋白在微管骨架上的步進行為

文獻來源：

Reck-Peterson SL, Yildiz A, Carter AP, Gennerich A, Zhang N, Vale RD. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 2006;126(2):335-48.