如何高效地解決免疫試劑中非特異性干擾的問題

免疫檢測技術(shù)（如ELISA、化學(xué)發(fā)光、膠體金試紙條等）是體外診斷（IVD）的核心手段，但非特異性干擾一直是影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的“隱形殺手”。本文將探討系統(tǒng)性解決方案。

一、什么是非特異性干擾？
在免疫反應(yīng)中，非目標(biāo)分子（如雜蛋白、類風(fēng)濕因子、嗜異性抗體等）或試劑成分因物理吸附、交叉反應(yīng)等機(jī)制，與檢測系統(tǒng)中的固相載體、標(biāo)記物或目標(biāo)抗體發(fā)生非預(yù)期結(jié)合，導(dǎo)致信號異常的現(xiàn)象。

二、常見干擾來源
1. 非特異性吸附干擾
成因：樣本/試劑中的蛋白質(zhì)、脂類通過范德華力、靜電作用吸附到固相載體（如微孔板、磁珠）或管路表面。

蛋白質(zhì)的吸附是一個復(fù)雜的過程，可以被不同的作用力驅(qū)動，如疏水作用、靜電作用以及構(gòu)象變化等。蛋白質(zhì)在材料表面及自身的吸附與很多因素有關(guān)，包括材料的化學(xué)組成、親疏水性、表面電荷、形貌結(jié)構(gòu)、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)等。
影響因素：
·內(nèi)包材
IVD產(chǎn)品的內(nèi)包材多為塑料材質(zhì)，如PE、PP、PET等，材料表面為烷烴基團(tuán)或芳香基團(tuán)，呈現(xiàn)明顯的疏水性。疏水作用是蛋白質(zhì)非特異性吸附的主要原因。

·載體
磁性顆粒（微球）、納米聚苯乙烯羧基微球、彩色微球等。微球表面羧基基團(tuán)提供靜電作用，其表面電荷與蛋白電荷相反時相互吸附，發(fā)生非特異性反應(yīng)。


·蛋白質(zhì)
蛋白質(zhì)由多種氨基酸殘基組成，親水性、疏水性的氨基酸殘基都有，其中疏水性氨基酸有蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等；羥基、氨基等基團(tuán)發(fā)生氫鍵作用。

2. 交叉反應(yīng)干擾
成因：抗體與除其特異抗原之外的其他抗原發(fā)生反應(yīng)的現(xiàn)象，這種反應(yīng)發(fā)生的原因是抗原結(jié)構(gòu)相似。當(dāng)抗原結(jié)構(gòu)相似時，抗體可能會識別并與多個抗原發(fā)生反應(yīng)（如抗HCG抗體誤結(jié)合FSH）。


常見干擾物質(zhì)：
·人抗鼠抗體（Human anti-mouse Antibodies，HAMA）
原理：人體中人抗鼠抗體對鼠源性抗體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，對于鼠源性抗體標(biāo)記的試劑干擾尤為明顯。
人抗鼠抗體產(chǎn)生原因：在早期的單克隆抗體治療中，由于使用的是來自小鼠的單克隆抗體，這些抗體對人類來說是異源的，因此人體免疫系統(tǒng)會將其識別為外來物質(zhì)并產(chǎn)生相應(yīng)的抗體來對抗它們。
·嗜異性抗體（Id）
原理：人體中嗜異性抗體對多種動物免疫球蛋白IgG Fab區(qū)域的非特異性反應(yīng)
嗜異性抗體（Id）主要由低純度抗原導(dǎo)致，它們不是針對特定抗原的特異性反應(yīng)，而是對多種動物免疫球蛋白的非特異性結(jié)合。
嗜異性抗體可能導(dǎo)致免疫分析中的假陽性或假陰性結(jié)果，因為它們可能交聯(lián)固相和酶標(biāo)抗體，從而影響檢測結(jié)果。
在肌鈣蛋白檢測中，嗜異性抗體是一個常見的假陽性原因，尤其是在急性冠脈綜合征的診斷中，可能導(dǎo)致不必要的治療或診斷程序。
嗜異性抗體的產(chǎn)生可能與病毒性疾病、動物接觸、疫苗接種、自身免疫疾病或某些藥物有關(guān)。估計人群中嗜異性抗體的流行率為0.7%-3.7%。
識別和處理嗜異性抗體干擾的方法包括稀釋樣本、物理化學(xué)方法（如超速離心、樣本加熱）、使用阻斷劑或選擇不同的檢測系統(tǒng)。
·類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）
類風(fēng)濕因子是一種抗人或動物IgG分子Fc片段抗原決定簇的抗體，是以變性IgG為靶抗原的自身抗體，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清中普遍。
·補(bǔ)體（complement，C）
抗體分子發(fā)生變構(gòu)，其Fc段的C1q分子結(jié)合位點被暴露出來，激活補(bǔ)體分子與抗體結(jié)合，從而造成假陽性。
3. 樣本基質(zhì)干擾
成因：血液/體液中的血紅蛋白、脂濁物質(zhì)、纖維蛋白原等影響光學(xué)信號或反應(yīng)效率。
4. 試劑自身干擾
成因：酶標(biāo)記物聚集、緩沖液離子強(qiáng)度失衡等引發(fā)非特異性結(jié)合。

大多數(shù)所謂的干擾效應(yīng)都是基于基質(zhì)成分（如人血清樣本中的血清蛋白）與待測物或抗體之間不需要的低或中親和力結(jié)合。
待測物可能會被樣本中的蛋白質(zhì)或其他成分所掩蓋，從而導(dǎo)致抗體不能與待測物結(jié)合。此外，基質(zhì)成分也可能會掩蓋抗體。選擇合適的抗干擾劑可大幅度的減少非特異性干擾。
那么我們可以如何高效地解決非特異性吸附等問題呢？
在實驗過程中，可以加入封閉劑，可以有效的封閉待封閉的點位，形成致密保護(hù)層，抑制非特異性吸附。封閉劑還可以維持抗體三維結(jié)構(gòu)，抗體利用率提升，使試劑線性范圍更大。
微球上的羧基經(jīng)活化劑EDC/NHS作用下形成中間體，與抗體上氨基反應(yīng)形成酰胺鍵，得到抗體/微球結(jié)合復(fù)合物，未結(jié)合的羧基位點用含氨基的封閉劑進(jìn)行封閉劑。

適用范圍：
封閉劑可用于封閉微球表面的化學(xué)基團(tuán)，降低非特異性吸附，提升試劑產(chǎn)品的穩(wěn)定性和靈敏度。主要適用于
·膠乳免疫比濁法試劑（膠乳增強(qiáng)免疫比濁法）
·磁微�；瘜W(xué)發(fā)光法試劑
·側(cè)向?qū)游龇ㄔ噭�（時間分辨熒光免疫分析法、上轉(zhuǎn)發(fā)光法）
也可以在實驗過程中加入抗干擾劑，從而降低樣本基質(zhì)中非待測物（蛋白類/脂肪類/細(xì)胞碎片等）與試劑中微球或抗體之間的非特異性吸附。
交叉反應(yīng)解決方案：

阻斷劑：有助于消除免疫分析中微弱或中等的親和交叉反應(yīng)（HAMA/RF/ID/補(bǔ)體等）所帶來的干擾，成功地將各種干擾因素的影響降至低，成為有經(jīng)濟(jì)效益的解決方法。
解決非特異性干擾需要“預(yù)防-阻斷-清除”三位一體的策略。隨著表面化學(xué)、抗體工程等技術(shù)的進(jìn)步，未來免疫檢測的準(zhǔn)確性將邁向新高度。對于IVD企業(yè)而言，建立從原料篩選到工藝驗證的全流程質(zhì)控體系，是突破這一技術(shù)瓶頸的關(guān)鍵。