基于量子點(diǎn)的單分子熒光示蹤技術(shù)揭示肌球蛋白馬達(dá)的步進(jìn)模式

一個(gè)真核細(xì)胞中有近百個(gè)不同的分子馬達(dá)，各自有不同的作用機(jī)制，分別與其承擔(dān)的獨(dú)特生理功能相適應(yīng)。其中肌球蛋白是一個(gè)廣泛存在的馬達(dá)蛋白，在細(xì)胞內(nèi)吞、蛋白分泌、囊泡運(yùn)輸、維持高爾基體形態(tài)等方面具有重要作用。日本大阪大學(xué)的Toshio Yanagida課題組，利用單分子熒光示蹤技術(shù)，觀察分析了肌球蛋白（Myosin VI）在細(xì)胞骨架上的步進(jìn)模式，相關(guān)成果發(fā)表于《CELL》。

So Nishikawa等構(gòu)建了肌球蛋白的昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)載體，并將HaloTag和6×His-tag整合入表達(dá)載體中。以鎳柱純化重組蛋白，加入HaloTag PEG-Biotin配體，實(shí)現(xiàn)肌球蛋白的生物素化。最后應(yīng)用鏈霉親合素偶聯(lián)的量子點(diǎn)（Streptavidin conjugated Quantum Dots, SA-QDs），利用生物素-親和素的結(jié)合特性，完成量子點(diǎn)對(duì)肌球蛋白的標(biāo)記（圖1及圖2）。對(duì)于量子點(diǎn)標(biāo)記肌球蛋白沿著微絲骨架移動(dòng)的示蹤，采用全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRFM）和奧林巴斯落射熒光顯微鏡成像，以EMCCD采集圖像，以相關(guān)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，量子點(diǎn)標(biāo)記沒有對(duì)肌球蛋白的移動(dòng)產(chǎn)生空間位阻；與綠色熒光蛋白（GFP）比較，量子點(diǎn)熒光探針具有更好的時(shí)間和空間分辨率。研究者揭示了肌球蛋白馬達(dá)大小兩種步距之間轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制，對(duì)于深刻認(rèn)識(shí)馬達(dá)蛋白作用機(jī)制具有重要的理論意義。

圖1 以量子點(diǎn)標(biāo)記肌球蛋白頭部并觀察其步進(jìn)行為

圖2 以不同顏色量子點(diǎn)分別標(biāo)記肌球蛋白的兩個(gè)頭部并觀察其步進(jìn)行為

文獻(xiàn)來源：

Nishikawa S, Arimoto I, Ikezaki K, Sugawa M, Ueno H, Komori T, Iwane AH, Yanagida T. Switch between large hand-over-hand and small inchworm-like steps in myosin VI. Cell 2010;142(6):879-88.