Science文章：Inscopix揭示飲酒對大腦、身體的影響

很多人都很喜歡飲酒，而不是長期依賴飲酒，但也有一部分人飲酒是無法戒掉的酒精依賴癥。通過使用滔博生物inscopix超微顯微成像技術(shù)進行小鼠的飲酒實驗，酒精依賴癥的小鼠從“第一次飲酒時”開始，大腦的反應就和其他小鼠不同了。

大多數(shù)研究酒精依賴癥的原因和治療方法的科學家，都傾向于將基因作為預測酒精依賴癥可能性的方法。迄今為止的研究表明，與酒精依賴癥相關(guān)的基因有數(shù)百個之多，但單憑遺傳學還不能完全解釋“酒精依賴癥患者”和“能與酒健康交往”之間的區(qū)別。

Kay M. Tye

索克研究所的神經(jīng)科學家Kay M. Tye的研究小組，作為預測酒精依賴癥的方法，不是著眼于遺傳基因，而是著眼于大腦的活動進行了實驗。相關(guān)工作發(fā)表在《Science》上，題為“A cortical-brainstem circuit predicts and governs compulsive alcohol drinking”。在這次的實驗中，使用遺傳相同的雄性小鼠，一點點地讓小鼠飲酒，通過使用滔博生物(4009-659-906)中國獨家代理美國Inscopix公司的nVista自由活動超微顯微成像方法監(jiān)測了飲酒的小鼠前額葉皮層的神經(jīng)元活動情況，在同樣接觸過酒精的小鼠上，個體對于暴飲暴食的差異性，揭示出飲酒和強迫性飲酒的潛在特征。在酗酒之前，大腦皮層神經(jīng)元投射到腦干的獨特的神經(jīng)活動特征預示著強迫性飲酒行為的最終出現(xiàn)。模仿預測飲酒表型的活動模式足以雙向調(diào)節(jié)飲酒。這項研究結(jié)果為強迫性飲酒的個體差異提供了一種機制上的解釋。

結(jié)果1. 跟蹤強迫性飲酒個體差異出現(xiàn)的“暴飲暴食誘發(fā)強迫任務”(BICT)

為了評估易感性如何與經(jīng)驗相互作用從而產(chǎn)生強迫飲酒，作者開發(fā)了一個“暴飲暴食誘發(fā)強迫任務”(BICT)。開始，通過聽覺條件刺激(CS+)預測酒的釋放，直到動物建立了條件反應。在暴飲前(第1天至第3天)，CS+預測酒單獨釋放(15%)。在第4天到第5天，在酒中增加了奎寧(一種用來懲罰的苦味劑)。在暴飲期間(第6天至第19天)，動物每天0、2或4小時可以無限制地獲得水和酒精，從而產(chǎn)生高水平的“暴飲式”酒精攝入(22)。在暴飲后(第20天至第26天)，動物回到暴飲前條件作用的環(huán)境中，其中酒精單獨出現(xiàn)3天，接下來4天出現(xiàn)酒精+奎寧(圖1A)。

BICT允許對與AUDs診斷標準相關(guān)的兩種行為結(jié)果進行縱向評估：飲酒和盡管出現(xiàn)不良結(jié)果仍繼續(xù)飲酒。暴飲后，無論奎寧是否存在，飲酒的個體差異都很大(圖1B)。根據(jù)暴飲后行為進行了三種表型分類：表現(xiàn)出低酒精攝入量和未受懲罰的小鼠被稱為“低飲酒者”;表現(xiàn)出大量飲酒但對懲罰很敏感的老鼠被稱為“酗酒者”;持續(xù)高水平飲酒的小鼠被稱為“強迫者”(圖1C)。只含酒精和酒精+奎寧分布的值相加，形成每個動物的“酒精使用指數(shù)”(圖1D)。

根據(jù)每只動物在暴飲后的行為對其進行分類，并對其進行追溯。最終被分成三個亞組的小鼠在酗酒前的純酒精攝入量沒有明顯的差異(圖1E)。酗酒后，即使沒有懲罰，低飲酒者的攝入量也會下降(圖1F。在酗酒之前，根據(jù)奎寧的濃度來衡量，強迫動物比低飲酒者和高飲酒者表現(xiàn)出更強的懲罰抵抗能力(圖1G)。酗酒后，由于強迫動物對懲罰表現(xiàn)出強烈的不敏感性，這種表型被加劇(圖1H)�？v向檢查顯示，當懲罰存在時，各組間存在顯著差異：酗酒者在暴飲后對奎寧對酒精攝入的影響表現(xiàn)出更高的敏感性，而強迫性動物則表現(xiàn)出更低的敏感性。

圖1 跟蹤強迫性飲酒個體差異出現(xiàn)的Binge-induced task (BICT)。

2. 最初飲酒時mPFC-dPAG神經(jīng)元的活動是未來類似飲酒行為的易損性標記

作者推斷，涉及“自上而下”控制回避行為的mPFC環(huán)路可能是形成強迫性飲酒行為的易感性的基礎(chǔ)。導水管周圍灰質(zhì)(PAG)參與對厭惡事件的反應，以及酒精戒斷期的負性情感狀態(tài)和痛覺過敏。投射到背側(cè)PAG (mPFC- dpag)的mPFC神經(jīng)元編碼厭惡事件。作者假設，mPFC-dPAG神經(jīng)元的功能缺陷可能會破壞厭惡過程，從而導致強迫性飲酒。

為了清晰了解mPFC-dPAG神經(jīng)元的活動，作者使用自由活動超微顯微成像(30)在BICT期間可視化mPFC-dPAG神經(jīng)元的活動(圖2)。順行病毒允許cre依賴表達GCaMP6m mPFC和逆行注射的病毒攜帶cre重組酶注入dPAG(圖2)。使用植入透鏡和nVista頭戴式顯微鏡對mPFC的神經(jīng)元進行成像觀察。在第一次暴飲前，對352個圍繞飲酒開始的神經(jīng)元的活動進行了分層聚類，發(fā)現(xiàn)了8個不同的聚類(圖2、D和E)。

盡管在整個暴飲前的“只喝酒精飲料”過程中，各組之間的酒精攝入量沒有差異，但在飲酒期間mPFC-dPAG神經(jīng)元的動態(tài)在表型組之間存在差異(圖2F)。在最初的飲酒體驗(第一天)中，與低飲酒者相比，強迫性動物的mPFC-dPAG神經(jīng)元表現(xiàn)出更多的抑制反應(圖2G)。低飲酒者的mPFC-dPAG神經(jīng)元在飲酒時表現(xiàn)出更強的興奮性(圖2H)。

雖然在初始酒精暴露期間，各組之間的行為表現(xiàn)沒有可檢測到的差異(圖1B和E)，但初始暴飲期間的神經(jīng)反應預測了強迫飲酒的未來發(fā)展(圖2F到H)。每個動物的單個mPFC-DPAG神經(jīng)元的興奮性和抑制性反應的比例與暴飲前(圖2I)或狂飲(圖2J)期間的行為不相關(guān)，但確實與收集了初始暴露期間的神經(jīng)記錄后>2周的暴飲行為相關(guān)(圖2K)。支持向量機基于先前試驗中飲酒期間mPFC-DPAG神經(jīng)元的活動解碼飲酒(GO)和不飲酒(NO GO)的未來行為選擇(圖2)。這支持了這樣一種觀點，即mPFC-DPAG神經(jīng)環(huán)路在觸發(fā)從適度飲酒到強制飲酒的轉(zhuǎn)變中起著關(guān)鍵作用。

圖2 最初飲酒時mPFC-dPAG神經(jīng)元的活動是未來類似飲酒行為的易損性標記

 3. mPFC-dPAG神經(jīng)元的抑制會導致強迫性飲酒，但在沒有懲罰的情況下不會改變飲酒

為了測試模仿內(nèi)源性活動是否可以改變行為，作者在mPFC神經(jīng)元中雙向表達鹵視紫紅質(zhì)(NpHR)，并在DPAG上植入雙側(cè)光纖(圖3A和圖3A)。在實時位置偏好測試中，與表達熒光團[增強型黃色熒光蛋白(EYFP)]的對照小鼠相比，NpHR小鼠顯示出對光抑制配對側(cè)腔室的適度偏好(圖3B)。光抑制沒有產(chǎn)生任何可檢測到的運動變化(圖3C)或焦慮相關(guān)行為。

動物被給予三次同時接觸酒精和水的機會，以建立酒精攝入量的基線水平(圖3D)。在第4天，奎寧僅被添加到酒中，奎寧濃度在不同時段增加，以評估面對懲罰時的酒精攝入量(圖3e)。在奎寧治療期間，接觸水或酒精會觸發(fā)光抑制，以模擬在舔酒過程中在強迫癥動物中觀察到的抑制活動(圖2H)。伴隨著舔酒精+奎寧溶液的光抑制足以誘導奎寧濃度響應曲線的右移，導致奎寧的IC50比EYFP對照增加兩倍以上(圖3F)，而不影響耗水量(圖3G)。當接觸酒精噴嘴會受到腳底電擊懲罰時(圖3H)，光抑制再次促進強迫飲酒(圖3I和圖3I)。

為了確定mPFC-DPAG活性的光抑制是否通過增加酒精的強化作用或降低對懲罰的敏感性來驅(qū)動強迫飲酒，作者隔離測量了每個成分。在沒有懲罰的情況下，光抑制不會改變酒精消費(圖3J和K)。為了確定在沒有獎勵的情況下光抑制是否改變了對有害刺激的反應，作者在動物尾巴浸泡在50°C的水中時對mPFC-DPAG突觸進行了光抑制，并發(fā)現(xiàn)光抑制延緩了退出的潛伏期。光抑制不支持顱內(nèi)自我刺激，也不改變操作性酒精自我給藥的消退。作者假設光抑制通過干擾懲罰信號從mPFC到DPAG的傳輸來驅(qū)動強迫性飲酒。雖然這個電路編碼刺激的厭惡方面，但它似乎并不是疼痛特有的，因為奎寧的作用是一種懲罰，但不是傷害性刺激(圖3)。

圖3 mPFC-dPAG神經(jīng)元的抑制會導致強迫性飲酒，但在沒有懲罰的情況下不會改變飲酒

4. mPFC-dPAG神經(jīng)元的激活模擬了懲罰對飲酒的影響

為了確定在這個mPFC-DPAG環(huán)路的興奮性活動對行為影響，作者在mPFC-DPAG神經(jīng)元中表達了通道視紫紅質(zhì)-2(ChR2)，并在mPFC上植入的光纖(圖4A和圖4A)。在實時位置厭惡試驗(圖4B)中避免了光刺激配對側(cè)，而不影響運動活動(圖4C)或焦慮相關(guān)行為(圖4C)。

為了測試mPFC-DPAG激活對飲酒的影響，作者再次使用了水和酒精的選擇任務，在該任務中，動物接觸水或酒精的瓶嘴觸發(fā)光刺激(圖4D)。酒精和水在整個實驗過程中保持不摻雜，提供給驅(qū)動光激發(fā)的光功率在不同的時段(10至130 mW/mm2)增加，隨后是沒有光刺激的恢復時段(圖4e)。光刺激足以作為一種懲罰，在舔酒精(圖4F)而不是水(圖4G)時產(chǎn)生光功率依賴性的減少，在恢復期間持續(xù)減少酒精消耗(圖4，H和I)。舔行為的微觀結(jié)構(gòu)分析揭示了光刺激引起的回合結(jié)構(gòu)和時間的變化。光刺激產(chǎn)生了強有力的和持久的前負荷行為的減少(在進入階段的最初部分喝了不成比例的酒精)，這是上癮樣行為的標志性措施。

圖4 mPFC-dPAG神經(jīng)元的激活模擬了懲罰對飲酒的影響

作者建立了一個行為模型，用于多維分析飲酒行為及其隨時間和經(jīng)驗的演變。作者鑒定了一種皮層-腦干神經(jīng)環(huán)路，它既是生物標志物，又是環(huán)路特異性細胞底物，會促進強迫性飲酒的發(fā)展。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激活環(huán)路的酒精依賴癥小鼠的飲酒傾向有所減少，顯示出通過操縱大腦活動可以改善酒精依賴癥的可能性。雖然，小鼠和人的大腦是不同的，這次的發(fā)現(xiàn)在實際的治療中被活用可能需要幾年的時間，但是研究結(jié)果對于酒精依存癥的治療是有希望的。
 

 

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