質(zhì)粒DNA純化和內(nèi)毒素去除

質(zhì)粒是在染色體或核區(qū)之外能夠自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，以超螺旋狀態(tài)存在，幾乎完全裸露，主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中。質(zhì)粒具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。
 

質(zhì)粒DNA廣泛應(yīng)用于基因工程、生物醫(yī)學(xué)的研究以及生物產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用。質(zhì)粒DNA純化是其應(yīng)用的關(guān)鍵步驟，直接影響到轉(zhuǎn)化、測(cè)序、PCR、酶切和轉(zhuǎn)染等下游實(shí)驗(yàn)。一般質(zhì)粒DNA約為2~20kb，初步純化的質(zhì)粒DNA構(gòu)型分為超螺旋、開口環(huán)狀及線性3種，其中超螺旋結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化和表達(dá)效率最高。質(zhì)粒DNA安全性好、毒性低和免疫原性較低、便于分離和提取，在DNA重組技術(shù)、轉(zhuǎn)基因方面有廣泛應(yīng)用。

內(nèi)毒素又稱脂多糖，是革蘭陰性菌外部細(xì)胞壁的主要成分。脂多糖由疏水的脂質(zhì)A部分、核心寡糖和雜多糖鏈及菌株特異性O(shè)抗原組成，其中脂質(zhì)A部分是分子內(nèi)毒素活性的原因。盡管脂質(zhì)A不會(huì)直接傷害任何組織，但人類和動(dòng)物的免疫細(xì)胞都將其視為存在細(xì)菌的指示劑。

在質(zhì)粒DNA制備的菌體裂解過程中，內(nèi)毒素分子被釋放到溶菌液中。由于內(nèi)毒素常形成囊狀結(jié)構(gòu)，其分子量、電荷性和疏水性都與質(zhì)粒DNA相似，常用的純化方法很難將內(nèi)毒素與質(zhì)粒DNA分開。內(nèi)毒素會(huì)降低原代細(xì)胞和敏感培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，干擾免疫細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染。內(nèi)毒素還會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)熱、低血壓、呼吸窘迫、血管內(nèi)凝血及內(nèi)毒素性休克綜合癥，內(nèi)毒素可通過激活TLR4刺激炎癥因子IL-1、IL-6、IL-10及TNF-x的合成。國家藥監(jiān)局規(guī)定，DNA疫苗制品中內(nèi)毒素含量不得高于0.01EU/ug，個(gè)人用劑量不超過20EU。

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