根據(jù)熔解曲線與Ct值評(píng)價(jià)qPCR實(shí)驗(yàn)成功與否的方法

在以往推文中，我們?cè)敿?xì)介紹了 PCR 實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)與進(jìn)階技巧，解答了許多實(shí)驗(yàn)中常見的問題及解決方案。今天，我們將深入探索 qPCR 的兩位“隱形英雄”：熔解曲線和 Ct 值。它們看似“低調(diào)”，卻往往是分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素。讓我們一同揭開它們的的神秘面紗，聊聊 qPCR 的那些事兒！ 

Section.01
qPCR 快速回顧

qPCR 是什么?

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (Quantitative Real-time PCR，qPCR) 可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)  DNA 擴(kuò)增過程中的熒光信號(hào)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量分析。通過在  PCR 反應(yīng)體系中引入熒光探針或染料，使得每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中產(chǎn)生的熒光信號(hào)可以被實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而反映出擴(kuò)增產(chǎn)物的量^[1]。

簡單來說，它就像 DNA 擴(kuò)增界的“股票走勢(shì)分析師”，實(shí)時(shí)告訴你擴(kuò)增了多少，何時(shí)到達(dá)“拐點(diǎn)” (Ct 值)。

圖 1. qPCR 流程圖^[1]。

01
小貼士

SYBR Green 和 TaqMan 是實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (qPCR) 中兩種常用的檢測(cè)探針，各自具有不同的優(yōu)缺點(diǎn)。以下是這兩種方法的對(duì)比：

qPCR 結(jié)果分析: 三大核心指標(biāo)
• 擴(kuò)增曲線 (Amplification Curve)：評(píng)估反應(yīng)效率的重要工具，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性和可靠性。
• Ct 值 (Cycle Threshold)：反應(yīng)樣品中靶標(biāo) DNA 的初始量，Ct 值越小，說明樣品中靶標(biāo) DNA 的初始量越多。
• 熔解曲線 (Melting Curve)：驗(yàn)證特異性的小助手，判斷是否有非特異擴(kuò)增或引物二聚體。

Section.02
擴(kuò)增曲線:
揭示 PCR 反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過程

擴(kuò)增曲線: PCR 實(shí)驗(yàn)的“成長軌跡”

擴(kuò)增曲線 (Amplification curve) 是指隨 PCR 反應(yīng)進(jìn)行，根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度隨著循環(huán)數(shù)變化而繪制的曲線。

圖 2. qPCR 擴(kuò)增曲線示意圖。

正常的擴(kuò)增曲線 (S 型) 包括四大“黃金階段”：基線期、指數(shù)增長期、線性增長期、平臺(tái)期。

• 基線期：“熱身階段”，通常出現(xiàn)在反應(yīng)的前 3 - 15 個(gè)循環(huán)內(nèi)。這一階段儀器會(huì)聰明地根據(jù)這段“無聲無息”的信號(hào)計(jì)算出基線范圍，為后續(xù)的“精彩瞬間”埋下伏筆。

• 指數(shù)增長期：PCR 反應(yīng)的“高潮時(shí)刻”，是擴(kuò)增曲線快速上升的階段。所有試劑都“活躍”了，DNA 聚合酶就像賽車手，快速合成，反應(yīng)也達(dá)到了最佳效率——這就是“指數(shù)”的威力！這一階段是做定量分析的最佳時(shí)期，PCR 產(chǎn)物量和初始模板量質(zhì)檢幾乎可以畫出一條完美的直線。

• 線性增長期：PCR 反應(yīng)進(jìn)入“疲軟期”。隨著原料逐漸耗盡，DNA 聚合酶開始“累了”，反應(yīng)效率逐漸降低，熒光信號(hào)的增長速度慢慢放緩，產(chǎn)物量和初始模板量之間的指數(shù)關(guān)系開始變得不那么“準(zhǔn)確”。

• 平臺(tái)期：PCR 反應(yīng)到達(dá)“終點(diǎn)站”，這一階段熒光信號(hào)基本停滯不前，趨于平穩(wěn)，擴(kuò)增就此“畫上句號(hào)”。不同反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)間和信號(hào)高低不同，反應(yīng)的“完結(jié)”也各有差異。

擴(kuò)增曲線分析:
你的擴(kuò)增曲線是“黃金路線”還是“問題頻發(fā)”

 
Section.03
Ct 值: 解鎖你的定量密碼

Ct 值: PCR 實(shí)驗(yàn)的“拐點(diǎn)時(shí)刻”

Ct 值，全稱為 Cycle Threshold，即在 PCR 反應(yīng)中，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

簡單來說，Ct 值指在 PCR 反應(yīng)中的熒光信號(hào)突破了“背景噪音”，開始呈指數(shù)級(jí)上升時(shí)，對(duì)應(yīng)的那個(gè)“拐點(diǎn)”所處的循環(huán)次數(shù)，它告訴我們“什么時(shí)候開始有戲了”�？偨Y(jié)一句話，Ct 值就像是 PCR 實(shí)驗(yàn)中的“開場白”，它告訴你“什么時(shí)候開始精彩”！

Ct 值的范圍

Ct 值和起始模板量之間的關(guān)系就像參加跑步比賽，起跑線距離終點(diǎn)的遠(yuǎn)近決定了跨越終點(diǎn)的時(shí)間。簡單來說，起始模板量越多，PCR 反應(yīng)越快，Ct 值就越小；而起始模板量越少，反應(yīng)就會(huì)慢一些，Ct 值自然就會(huì)更大。

 
Section.04
熔解曲線:
一眼看穿“真假擴(kuò)增”

熔解曲線: DNA 的“解密時(shí)刻”

通過逐步提高溫度同時(shí)監(jiān)測(cè)每個(gè)溫度點(diǎn)的熒光信號(hào)變化，最終生成一條“熔解曲線” (Melting Curve)。隨著溫度上升，DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)開始解開，熒光信號(hào)從雙鏈中釋放出來，熒光信號(hào)下降，最終升高到 DNA 雙鏈解開 50% 的溫度即為溶解溫度 (Tm)，是 DNA 解鎖的關(guān)鍵溫度。

熔解曲線聽起來像是 DNA 在做一場高溫的“脫單”大典！它揭示了隨著溫度升高，DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)逐漸分開變成“單鏈情人”的過程，用于分析 PCR 產(chǎn)物的濃度、特點(diǎn)及純度。

圖 3. qPCR 熔解曲線示意圖。

熔解曲線分析:
你的熔解曲線是“好演員”還是“草臺(tái)班子”?

 
Section.05
小結(jié)

qPCR 實(shí)驗(yàn)中，Ct 值幫你量化基因表達(dá)，熔解曲線幫你驗(yàn)證特異性。強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合堪稱 qPCR 實(shí)驗(yàn)成功的“黃金搭檔”。所以，下次當(dāng)你看到漂亮的 Ct 值和干凈的熔解曲線時(shí)，不妨給自己點(diǎn)個(gè)贊！

關(guān)注我們，帶你玩轉(zhuǎn)分子生物學(xué)的每一個(gè)細(xì)節(jié)，實(shí)驗(yàn)成功就是這么簡單！歡迎留言分享，讓我們一起成為 qPCR 實(shí)驗(yàn)的高手。
 

[1] Grace Adams. A beginner’s guide to RT-PCR, qPCR and RT-qPCR. Biochem (Lond) 22 June 2020; 42 (3): 48–53.