關(guān)于培養(yǎng)細(xì)胞樣品處理方法
1.對于培養(yǎng)細(xì)胞樣品：
a.融解Western及IP細(xì)胞裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM，或者根據(jù)實驗需要加入適當(dāng)?shù)纳鲜龅鞍酌噶姿崦敢种苿┗旌衔铩?br />
b.對于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸動物細(xì)胞1-2秒后，細(xì)胞就會被裂解。植物細(xì)胞宜在冰上裂解2-10min。
對于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，輕輕vortex或者彈擊管底以把細(xì)胞盡量分散開。按照6孔板每孔細(xì)胞加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。輕彈管底以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50-100萬細(xì)胞/管，然后再裂解。大團的細(xì)胞較難裂解充分，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。
對于細(xì)菌或酵母：對于1ml菌液或酵母液，離心去上清，如果有必要可以使用PBS洗滌一次，充分去除液體后，輕輕vortex或者彈擊管底以把細(xì)菌或酵母盡量彈散。加入100-200微升裂解液，輕輕vortex或者彈擊管底以混勻，冰上裂解2-10min。如果希望獲得更好的裂解效果，細(xì)菌和酵母可以分別使用溶菌酶和破壁酶(Lyticase)消化，然后再使用本裂解液進行裂解。
裂解液用量說明：通常6孔板每孔細(xì)胞或者1ml的菌液或酵母液中的細(xì)菌和酵母量加入100微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到150微升或200微升。每100萬動物細(xì)胞用100微升本產(chǎn)品裂解后獲得的上清，其蛋白濃度約為2-4mg/ml，不同細(xì)胞有所不同。
c.充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
2.對于組織樣品：
a.把組織剪切成細(xì)小的碎片。
b.融解Western及IP細(xì)胞裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM，或者根據(jù)實驗需要加入適當(dāng)?shù)纳鲜龅鞍酌噶姿崦敢种苿┗旌衔铩?br />
c.按照每20毫克組織加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。)
d.用玻璃勻漿器勻漿，磨，直至充分裂解。也可以把組織樣品冷凍后液氮研磨，研磨充分后加入裂解液進行裂解。
e.充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。每20mg凍存的小鼠肝臟組織用200微升本裂解液裂解后獲得的上清，其蛋白濃度約為15-25mg/ml，不同狀態(tài)的不同組織有所不同。
f.如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，不必使用勻漿器或研磨設(shè)備，缺點是不如勻漿或研磨那樣裂解比較充分。
附錄：生產(chǎn)的各種裂解液主要特點、差異和選擇
首先請參考下表，了解各種裂解液的主要特點和差異。
| 產(chǎn)品編號 | P0013 | P0013B | P0013C | P0013D | P0013F | P0013G | P0013J | P0013K |
| 產(chǎn)品名稱 | Western及IP細(xì)胞裂解液 | RIPA裂解液(強) | RIPA裂解液(中) | RIPA裂解液(弱) | NP-40裂解液 | SDS裂解液 | Western及IP細(xì)胞裂解液(無抑制劑) | RIPA裂解液(強，無抑制劑) |
| 有效裂解成分 | 1% Triton X-100 | 1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS | 1% NP-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS | 1% NP-40, 0.25% deoxycholate | 1% NP-40 | 1% SDS | 1% Triton X-100 | 1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS |
| 裂解強度 | 溫和 | 強 | 中 | 溫和 | 溫和 | 強 | 溫和 | 強 |
| 對膜蛋白的提取 | 一般 | 很好 | 較好 | 一般 | 一般 | 很好 | 一般 | 很好 |
| 對胞漿蛋白的提取 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 |
| 對核蛋白的提取 | 較好 | 很好 | 較好 | 較好 | 較好 | 很好 | 較好 | 很好 |
| 胞漿磷酸化蛋白提取 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 |
| 細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子提取 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 |
| 含蛋白酶抑制劑 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 否 | 否 |
| 含磷酸酯酶抑制劑 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 否 | 否 |
| 不同物種樣品兼容性 | 高 | 高 | 高 | 高 | 高 | 高 | 高 | 高 |
| 主要用途 | WB, IP,co-IP | WB, IP | WB, IP | WB, IP, co-IP | WB, IP,co-IP | WB, ChIP | WB, IP,co-IP | WB, IP |
用于普通的Western、IP或co-IP，我們推薦使用，該裂解液已被國內(nèi)各大研究機構(gòu)廣泛使用，發(fā)表大量SCI論文，用戶普遍反映很好。裂解細(xì)胞或組織后，沒有非常粘滯的透明狀DNA團塊形成，不必采用超聲處理等就可以非常理想地用于后續(xù)操作。另外該裂解液裂解的產(chǎn)物也適合用于磷酸化蛋白的Western檢測。
對于某些特殊蛋白的IP，如果發(fā)現(xiàn)效果不是非常理想，可以嘗試用RIPA裂解液(強、中或弱)或NP-40裂解液。如果發(fā)現(xiàn)IP的時候背景很高，即非特異的蛋白也被IP下來，則需要選用裂解強度較高的裂解液，例如RIPA裂解液(強或中)。如果發(fā)現(xiàn)目的蛋白無法被IP下來，則說明裂解液的強度過強，可以使用較為溫和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。
對于某些難溶解蛋白的Western，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細(xì)胞裂解液(效果不是非常理想，可以嘗試使用裂解強度更高的裂解液例如RIPA裂解液(強、中)或SDS裂解液。使用RIPA裂解液(強)的用戶也非常多，發(fā)表了大量SCI論文。
用于特定用途需要自行添加特定抑制劑或不需要添加抑制劑時，在很多時候可以兼容酶活性和生物小分子的檢測，對于特定的酶或生物小分子的檢測是否兼容需 要自行測試，不提供具體的應(yīng)用信息。的裂解能力比弱一些，但用于酶活性和生物小分子時，兼容性通常會更好一些。
