乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測方法

 方法一：LDH釋放檢測

a.根據(jù)細(xì)胞的大小和生長速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使待檢測時細(xì)胞密度不超過80-90%滿。
b.吸去培養(yǎng)液，用PBS液洗滌一次。換新鮮培養(yǎng)液(推薦使用含1%血清的低血清培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)臒o血清培養(yǎng)液)，將各培養(yǎng)孔分成如下幾組：包括無細(xì)胞的培養(yǎng)液孔(背景空白對照孔)，未經(jīng)藥物處理的對照細(xì)胞孔(樣品對照孔)，未經(jīng)藥物處理的用于后續(xù)裂解的細(xì)胞孔(樣品最大酶活性對照孔)，以及藥物處理的細(xì)胞孔(藥物處理樣品孔)，并做好標(biāo)記。按照實(shí)驗(yàn)需要給予適當(dāng)藥物處理如加入0-10μl左右特定的藥物刺激，可設(shè)置不同濃度，不同處理時間，對照孔中需加入適當(dāng)?shù)乃幬锶軇�對�?，繼續(xù)按常規(guī)培養(yǎng)。到預(yù)定的檢測時間點(diǎn)前1小時，從細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在“樣品最大酶活性對照孔”中加入試劑盒提供的LDH釋放試劑，加入量為原有培養(yǎng)液體積的10%。加入LDH釋放試劑后，反復(fù)吹打數(shù)次混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。
c.到達(dá)預(yù)定時間后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測定。
方法二：細(xì)胞內(nèi)總LDH的檢測
a.細(xì)胞毒性檢測：根據(jù)細(xì)胞的大小和生長速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，使待檢測時細(xì)胞密度不超過80-90%滿。加入不同藥物進(jìn)行處理，并設(shè)置適當(dāng)對照。藥物刺激完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。盡量吸除上清，加入150μl用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻，適當(dāng)搖晃培養(yǎng)板混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1小時。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測定。
b.細(xì)胞增殖檢測：根據(jù)細(xì)胞的大小和生長速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，使促進(jìn)細(xì)胞增殖的藥物刺激后細(xì)胞不超過80-90%滿為宜。使用不同的藥物刺激細(xì)胞，并設(shè)置適當(dāng)對照。藥物刺激完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。盡量吸除上清，加入150μl用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻)，適當(dāng)搖晃混勻胞，然后繼續(xù)在細(xì)培養(yǎng)箱中孵育1小時。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測定。
注：LDH釋放檢測更加常用一些，細(xì)胞內(nèi)總LDH檢測通�？梢允褂肕TT、WST-1或CCK-8等方法替代。
2. 試劑盒的準(zhǔn)備工作：
a.INT溶液(1X)的配制：根據(jù)所需的INT溶液(1X)的量，取適量INT溶液(10X)用INT稀釋液稀釋至1X。例如，取20μl INT溶液(10X)，加入180μl INT 稀釋液，混勻后即配制為200μl INT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜現(xiàn)配現(xiàn)用，配制后4℃保存可于當(dāng)天使用，不宜配制后凍存。
b.LDH檢測工作液的配制: 根據(jù)待測定的樣品數(shù)(含對照)，參考下表在臨檢測前新鮮配制適量的檢測工作液。
注意：LDH檢測工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制和使用過程中均要注意適當(dāng)避光。

c.(選做)如果希望進(jìn)行LDH酶活性的絕對定量，需自備LDH標(biāo)準(zhǔn)品，并新鮮配制不同濃度LDH標(biāo)準(zhǔn)品，如10mU/ml、5mU/ml、2.5mU/ml、1.25mU/ml、 0.65mU/ml、0 mU/ml。
3. 樣品測定:
a.各孔分別加入60μl LDH檢測工作液。
b.混勻，室溫(約25℃) 避光孵育30min(可用鋁箔包裹后置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動)。然后在490nm處測定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一 波長作為參考波長進(jìn)行雙波長測定。
c.計算(測得的各組吸光度均應(yīng)減去背景空白對照孔吸光度)
d.細(xì)胞毒性或死亡率(%)=(處理樣品吸光度－樣品對照孔吸光度) / (細(xì)胞最大酶活性的吸光度－樣品對照孔吸光度)×100
e.可繪制細(xì)胞毒性曲線：縱座標(biāo)為實(shí)際吸光度，橫坐標(biāo)為藥物濃度；據(jù)此可計算該藥物作用特定時間的半致死劑量LD50。

附錄1：
可同時測定一已知濃度的LDH酶標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的吸光度值，參考以下公式粗略計算出樣品中LDH酶活力：
待測樣品中LDH活力單位(mU/ml)＝
(樣品孔吸光度－背景空白對照孔吸光度) / (標(biāo)準(zhǔn)管吸光度－標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mU/ml)；
根據(jù)計算結(jié)果可以比較不同樣品處理組間有無統(tǒng)計學(xué)差異等。

附錄2：
若需準(zhǔn)確計算出LDH酶活性的絕對活性，可通過一系列LDH標(biāo)準(zhǔn)品及相應(yīng)測得的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線相應(yīng)公式計算出樣品中LDH的酶活性。
各孔數(shù)值減去空白對照后，以檢測的吸光度(OD490)為縱坐標(biāo)，LDH酶活力(mU)為橫坐標(biāo)，繪制LDH標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時計算出該趨勢線的公式。

A_490nm＝k×LDH酶活力單位(mU)＋b，通過Excel等軟件計算 出趨勢線的斜率k和截距b。
根據(jù)上述公式計算樣品中LDH活力。
樣品實(shí)際吸光度(OD490)＝樣品孔測得的吸光度－背景空白對照孔吸光度
檢測體系中LDH酶活力單位(mU)=(OD490-b)/k
樣品中LDH酶活力(mU/ml)＝檢測體系中LDH酶活力單位(mU )/檢測樣品體積