細胞活力檢測準備
1.細胞的準備：
使用適合進行化學發(fā)光檢測的96孔板，每孔接種100μl細胞(如使用384孔板，每孔接種25μl細胞，具體用量視不同類型的384孔板而定)，并確保檢測時每孔的細胞數(shù)量在5萬個以內(如使用384孔板宜控制在1萬個以內)，同時設置不含細胞的培養(yǎng)液孔作為陰性對照，按照細胞培養(yǎng)的常規(guī)方法培養(yǎng)細胞。如有需要，可加入藥物處理細胞。此外，如有必要，也可以設置細胞的濃度梯度，以便后續(xù)確定試劑盒的使用效果。
2.ATP標準曲線的設置(選做)：
把自備的ATP標準溶液用PBS或細胞培養(yǎng)液稀釋成適當?shù)臐舛忍荻�。初次檢測可以設置0、10、30、100、300、1000、3000、10,000nM這幾個濃度，96孔板每孔加入100μl 的標準品。如有必要，在后續(xù)的實驗中可以根據(jù)細胞中的ATP含量對標準品的濃度范圍進行適當調整。如果用細胞培養(yǎng)液來稀釋ATP標準品，稀釋后需立即進行后續(xù)的發(fā)光檢測，否則培養(yǎng)液中的ATPase等可以消耗ATP的酶會導致ATP含量下降。
3.檢測試劑的準備：
a.融解凍存的CellTiter-Lumi™ Steady Plus發(fā)光法檢測試劑，如有必要可適當分裝該試劑。經測試反復凍融5次對其檢測效果無顯著影響。
b.按照96孔板每孔100μl (384孔板每孔25μl)的量，取適量CellTiter-Lumi™ Steady Plus發(fā)光法檢測試劑，平衡至室溫。
4.細胞活力檢測：
a.取出細胞培養(yǎng)板在室溫平衡10分鐘(通常不宜超過30分鐘)。
b.96孔板每孔加入100μl CellTiter-Lumi™ Steady Plus發(fā)光法檢測試劑(384孔板每孔25μl)。
c.室溫振蕩2分鐘，以促進細胞的裂解。
d.室溫(約25℃)孵育10分鐘，使發(fā)光信號趨于穩(wěn)定。
e.使用具有檢測化學發(fā)光功能的多功能酶標儀進行化學發(fā)光檢測。請根據(jù)儀器要求設置相應的參數(shù)，每個孔的檢測時間一般為0.25-1秒或更長時間，具體需根據(jù)儀器的檢測靈敏度進行適當?shù)恼{整。
f.根據(jù)化學發(fā)光讀數(shù)直接計算細胞的相對活力，或根據(jù)ATP標準曲線計算出ATP的量從而計算出細胞的相對活力。對于培養(yǎng)細胞和ATP標準品的檢測效果可以參考圖1和圖3，細胞在0-50,000個細胞/孔的細胞密度范圍內有良好的線性關系，ATP標準品0-10,000nM濃度范圍有良好的線性關系。注：檢測效果因細胞的種類不同而有所不同，對于一些ATP含量特別高的細胞，在細胞數(shù)量達到50,000個后可能會不呈現(xiàn)線性相關，但化學發(fā)光讀數(shù)還是會繼續(xù)升高的。
圖3. CellTiter-Lumi™ Steady Plus發(fā)光法細胞活力檢測試劑盒(CTL Steady Plus)對ATP標準品的檢測效果。實際檢測效果會因檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
常見問題：
1.Luminometer和熒光分光光度計有何不同？
熒光分光光度計檢測的樣品本身不能發(fā)光，樣品需要由特定波長的激發(fā)光激發(fā)，然后才能產生熒光并被熒光分光光度計檢測。Luminometer檢測的樣品本身可以發(fā)光，不需要激發(fā)光進行激發(fā)。也就是說luminometer是檢測化學發(fā)光(螢光)的儀器。有些型號的熒光分光光度計也具有l(wèi)uminometer的功能，即也可以檢測化學發(fā)光。您所使用的熒光分光光度計能否用于化學發(fā)光的測定請仔細閱讀該儀器的說明書。
2.可以進行螢光素酶報告基因檢測的儀器是否就可以用于本試劑盒的檢測？
是。螢光素酶報告基因的檢測原理和本試劑盒的原理相同，可以用相同的儀器測定。
使用適合進行化學發(fā)光檢測的96孔板，每孔接種100μl細胞(如使用384孔板，每孔接種25μl細胞，具體用量視不同類型的384孔板而定)，并確保檢測時每孔的細胞數(shù)量在5萬個以內(如使用384孔板宜控制在1萬個以內)，同時設置不含細胞的培養(yǎng)液孔作為陰性對照，按照細胞培養(yǎng)的常規(guī)方法培養(yǎng)細胞。如有需要，可加入藥物處理細胞。此外，如有必要，也可以設置細胞的濃度梯度，以便后續(xù)確定試劑盒的使用效果。
2.ATP標準曲線的設置(選做)：
把自備的ATP標準溶液用PBS或細胞培養(yǎng)液稀釋成適當?shù)臐舛忍荻�。初次檢測可以設置0、10、30、100、300、1000、3000、10,000nM這幾個濃度，96孔板每孔加入100μl 的標準品。如有必要，在后續(xù)的實驗中可以根據(jù)細胞中的ATP含量對標準品的濃度范圍進行適當調整。如果用細胞培養(yǎng)液來稀釋ATP標準品，稀釋后需立即進行后續(xù)的發(fā)光檢測，否則培養(yǎng)液中的ATPase等可以消耗ATP的酶會導致ATP含量下降。
3.檢測試劑的準備：
a.融解凍存的CellTiter-Lumi™ Steady Plus發(fā)光法檢測試劑，如有必要可適當分裝該試劑。經測試反復凍融5次對其檢測效果無顯著影響。
b.按照96孔板每孔100μl (384孔板每孔25μl)的量，取適量CellTiter-Lumi™ Steady Plus發(fā)光法檢測試劑，平衡至室溫。
4.細胞活力檢測：
a.取出細胞培養(yǎng)板在室溫平衡10分鐘(通常不宜超過30分鐘)。
b.96孔板每孔加入100μl CellTiter-Lumi™ Steady Plus發(fā)光法檢測試劑(384孔板每孔25μl)。
c.室溫振蕩2分鐘，以促進細胞的裂解。
d.室溫(約25℃)孵育10分鐘，使發(fā)光信號趨于穩(wěn)定。
e.使用具有檢測化學發(fā)光功能的多功能酶標儀進行化學發(fā)光檢測。請根據(jù)儀器要求設置相應的參數(shù)，每個孔的檢測時間一般為0.25-1秒或更長時間，具體需根據(jù)儀器的檢測靈敏度進行適當?shù)恼{整。
f.根據(jù)化學發(fā)光讀數(shù)直接計算細胞的相對活力，或根據(jù)ATP標準曲線計算出ATP的量從而計算出細胞的相對活力。對于培養(yǎng)細胞和ATP標準品的檢測效果可以參考圖1和圖3，細胞在0-50,000個細胞/孔的細胞密度范圍內有良好的線性關系，ATP標準品0-10,000nM濃度范圍有良好的線性關系。注：檢測效果因細胞的種類不同而有所不同，對于一些ATP含量特別高的細胞，在細胞數(shù)量達到50,000個后可能會不呈現(xiàn)線性相關，但化學發(fā)光讀數(shù)還是會繼續(xù)升高的。
常見問題：
1.Luminometer和熒光分光光度計有何不同？
熒光分光光度計檢測的樣品本身不能發(fā)光，樣品需要由特定波長的激發(fā)光激發(fā)，然后才能產生熒光并被熒光分光光度計檢測。Luminometer檢測的樣品本身可以發(fā)光，不需要激發(fā)光進行激發(fā)。也就是說luminometer是檢測化學發(fā)光(螢光)的儀器。有些型號的熒光分光光度計也具有l(wèi)uminometer的功能，即也可以檢測化學發(fā)光。您所使用的熒光分光光度計能否用于化學發(fā)光的測定請仔細閱讀該儀器的說明書。
2.可以進行螢光素酶報告基因檢測的儀器是否就可以用于本試劑盒的檢測？
是。螢光素酶報告基因的檢測原理和本試劑盒的原理相同，可以用相同的儀器測定。
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