細(xì)胞增殖檢測(DAB法)方法
1. 需要用戶自己準(zhǔn)備的耗材和試劑
a. PBS ，或PBS (pH7.2-7.6)。
b. 固定液(免疫染色固定液，或4%的多聚甲醛P0099)。
c. 洗滌液(免疫染色封閉液，QuickBlock™免疫染色封閉液或，或PBS)。
d. 通透液免疫染色強(qiáng)力通透液，免疫染色洗滌液，或含0.3% Triton X-100的PBS)。
e. 內(nèi)源性過氧化物酶封閉液(內(nèi)源性過氧化物酶封閉液，甲醇或PBS配制的0.3%過氧化氫溶液)。
f. 去離子水或超純水。
g. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求：18×18mm蓋玻片，6孔板或其它多孔板。
2. 檢測體系的準(zhǔn)備
a. 如下以6孔板或常規(guī)切片檢測體系為例，如果使用12孔板、96孔板或384孔板等孔板，檢測體系可以相應(yīng)按比例縮小。
b. 如果檢測的是懸浮細(xì)胞，請按常規(guī)的懸浮細(xì)胞的操作方式進(jìn)行。例如和貼壁細(xì)胞相比，相關(guān)步驟需要增加離心步驟等。
3. 培養(yǎng)細(xì)胞的EdU標(biāo)記及固定、洗滌和通透
a. 在6孔板中(如有必要可以加入蓋玻片)培養(yǎng)適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)過夜并且恢復(fù)到正常狀態(tài)后，進(jìn)行所需的藥物處理或者其它刺激處理等。
b. 配制2X的EdU工作液：由于EdU工作液是與培養(yǎng)液等體積加入到孔板中，所以需要配制成2X的工作液。推薦的EdU終濃度為10μM (1X)，用細(xì)胞培養(yǎng)液1:500稀釋EdU (10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。
注意：對于A549、HeLa和NIH/3T3等貼壁細(xì)胞，推薦EdU的使用終濃度為10μM。但細(xì)胞類型、培養(yǎng)液種類、細(xì)胞密度、細(xì)胞增殖速度等多方面的因素會影響EdU摻入到細(xì)胞中的量，因此初次使用時(shí)建議對EdU的使用濃度進(jìn)行一定的摸索。如果之前使用過BrdU進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。
c. 將37℃預(yù)熱的2X的EdU工作液(20μM)，等體積加入6孔板中，使6孔板中的EdU終濃度變?yōu)?X。例如設(shè)計(jì)終濃度為10μM，原先6孔板中的培養(yǎng)基為1ml，則將1ml 2X的EdU工作液(20μM)加入到孔板中。如果培養(yǎng)基體積過大，可以先吸除適量的培養(yǎng)液，再加入等體積的2X的EdU工作液；或者可以減少工作液的體積并增加EdU的濃度，使最終培養(yǎng)液中的EdU濃度為10μM，例如2ml培養(yǎng)液中加入220微升0.1mM EdU。更換所有的培養(yǎng)液可能會對細(xì)胞的增殖有影響，因此不建議替換所有的培養(yǎng)液。
d. 繼續(xù)孵育細(xì)胞2小時(shí)。該孵育時(shí)間的長短取決于細(xì)胞生長速率，通常宜繼續(xù)孵育細(xì)胞周期10%左右的時(shí)間。對于常見的哺乳動物細(xì)胞如HeLa、3T3、HEK293等，細(xì)胞周期大約在18-25小時(shí)，孵育時(shí)間宜在2小時(shí)左右。人胚胎細(xì)胞的細(xì)胞周期約30分鐘，推薦的孵育時(shí)間為5分鐘；酵母細(xì)胞的細(xì)胞周期約3小時(shí)，推薦的孵育時(shí)間為20分鐘，增殖的神經(jīng)細(xì)胞其細(xì)胞周期約5天，推薦的孵育時(shí)間為1天。孵育時(shí)間小于45分鐘時(shí)，建議提高EdU的濃度；孵育時(shí)間大于20小時(shí)時(shí)，建議適當(dāng)降低EdU的濃度。
e. EdU標(biāo)記細(xì)胞完成后，去除培養(yǎng)液，并加入1ml固定液(可以使用免疫染色固定液P0098，或4%的多聚甲醛P0099)，室溫固定15分鐘。
f. 去除固定液，每孔用1ml洗滌液洗滌細(xì)胞3次，每次3-5分鐘。
g. 去除洗滌液，每孔用1ml通透液(可以使用免疫染色強(qiáng)力通透液P0097，免疫染色洗滌液P0106，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。
h. 去除通透液，每孔用1ml洗滌液洗滌細(xì)胞1-2次，每次3-5分鐘。
i. 再用內(nèi)源性過氧化物酶封閉液室溫孵育20分鐘，以滅活內(nèi)源的過氧化物酶。隨后用洗滌液洗滌3次，每次2分鐘。
j. 轉(zhuǎn)步驟5。
4. 動物體內(nèi)EdU的標(biāo)記及切片樣品的處理
EdU可以通過注射或進(jìn)食等適當(dāng)方式進(jìn)行動物的體內(nèi)標(biāo)記。如下以小鼠為例，其它動物體內(nèi)EdU的標(biāo)記請參考相關(guān)文獻(xiàn)。
a. 對于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定濃度，腹腔注射、特定組織或器官局部注射或者加入飲用水中。具體用量跟所用動物的種類、體重和使用方式有關(guān)，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)，因此初次使用時(shí)建議對EdU的使用濃度進(jìn)行一定的摸索，或者直接使用50mg/kg的濃度進(jìn)行測試。如果之前使用過BrdU進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。EdU可以單獨(dú)購買。
b. 4小時(shí)后或根據(jù)特定實(shí)驗(yàn)確定的適當(dāng)時(shí)間后，快速處死小鼠，取出所需的組織，按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片。EdU標(biāo)記的時(shí)間也可以參考相關(guān)文獻(xiàn)自行調(diào)整。
c. 對于冰凍切片：
(a) 加入適量固定液(可以使用免疫染色固定液，或4%的多聚甲醛)，室溫固定15分鐘。
(b) 去除固定液，用適量洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
(c) 去除洗滌液，用適量通透液(可以使用免疫染色強(qiáng)力通透液，免疫染色洗滌液，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。
(d) 去除通透液，用適量洗滌液洗滌1-2次，每次3-5分鐘。
(e) 抗原修復(fù)(選做)：如果同時(shí)需要進(jìn)行目的蛋白的免疫熒光染色，并有必要進(jìn)行抗原修復(fù)，可以使用適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液，例如冰凍切片快速抗原修復(fù)液(5X)，或者自行配制的適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)處理。
(f) 用內(nèi)源性過氧化物酶封閉液室溫孵育20分鐘，以滅活切片內(nèi)源的過氧化物酶。隨后用洗滌液洗滌3次，每次2分鐘。
(g) 轉(zhuǎn)步驟5。
d. 對于石蠟切片：
(a) 脫蠟：二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘，換新的無水乙醇3分鐘。95%乙醇3分鐘。85%乙醇3分鐘。75%乙醇3分鐘。50%乙醇3分鐘。PBS 5分鐘。
(b) 抗原修復(fù)(選做)：如果同時(shí)需要進(jìn)行目的蛋白的免疫組化染色，可以使用適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液，例如檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(50X)、改進(jìn)型檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(50X)、 EDTA抗原修復(fù)液(50X)、檸檬酸鈉-EDTA抗原修復(fù)液(40X)、通用型強(qiáng)力抗原修復(fù)液(10X)、漂片抗原修復(fù)液(10X)，或者自行配制適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)處理。
特別注意：如果使用蛋白酶K或胰酶進(jìn)行抗原修復(fù)，必須反復(fù)洗滌干凈，否則殘留的酶會嚴(yán)重干擾后續(xù)標(biāo)記反應(yīng)。
(c) 用內(nèi)源性過氧化物酶封閉液室溫孵育20分鐘，以滅活切片內(nèi)源的過氧化物酶。隨后用洗滌液洗滌3次，每次2分鐘。
(d) 轉(zhuǎn)步驟5。
5. EdU檢測
注意：本步驟六孔板中每孔的反應(yīng)體系為500μl的反應(yīng)混合物。對于12、24、48、96和384孔板，每孔的反應(yīng)的體系分別為200μl、100μl、70μl、50μl和20μl的反應(yīng)混合物。對于較小的孔，單位培養(yǎng)面積的液體用量已經(jīng)適當(dāng)增加，以有效避免液體蒸發(fā)可能帶來的負(fù)面影響。對于切片，可以根據(jù)切片大小，每個(gè)切片使用100-200μl的反應(yīng)混合物。如下以六孔板中的細(xì)胞樣品為例說明具體的操作方法，對于其它孔板或切片，僅每步溶液的用量按比例調(diào)整即可，其余方法相同。
a. 配制Click Additive Solution：對于，用1.3ml去離子水溶解一管Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution；對于，加入10.4ml去離子水溶解試劑盒中提供的一瓶Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution。配制后可以適當(dāng)分裝，并-20℃保存。
b. 參考下表配制Click反應(yīng)液。注意：請嚴(yán)格按照下表中組分順序和體積配制Click反應(yīng)液，否則點(diǎn)擊反應(yīng)可能無法有效進(jìn)行；同時(shí)，Click反應(yīng)液須在配制后15分鐘內(nèi)使用。
c. 去除上一步驟中的洗滌液。
d. 每孔加入0.5ml Click反應(yīng)液，輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)混合物可以均勻覆蓋樣品。
e. 室溫避光孵育30分鐘。孵育時(shí)需注意在多孔板的空隙中加水，或者對于切片宜使用濕盒(例如載玻片染色盒)來保持濕潤，以盡量減少反應(yīng)液的蒸發(fā)。
f. 吸除Click反應(yīng)液，用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
6. Streptavidin-HRP工作液和DAB顯色液的配制：
a. Streptavidin-HRP工作液的配制：
參考下表配制適量的Streptavidin-HRP工作液，須充分混勻。注意：配制好的Streptavidin-HRP工作液必須一次使用完畢，不宜凍存。
b. DAB顯色液的配制：
按照每個(gè)樣品使用0.2-0.4ml顯色液的比例配制適量DAB顯色液。等體積混合適量DAB顯色液A和DAB顯色液B，充分混勻后即為DAB顯色液。注意：配制好的DAB顯色液必須一次使用完畢，不宜凍存。
7. 樣品的顯色：
a. 在樣品上加200μl Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30分鐘。
注意：Streptavidin-HRP工作液的用量以完全覆蓋樣品為準(zhǔn)。孵育時(shí)需注意在多孔板的空隙中加水，或者對于切片宜使用濕盒(例如載玻片染色盒)來保持濕潤，以盡量減少Streptavidin-HRP工作液的蒸發(fā)。
b. 用洗滌液洗滌3次，每次2分鐘。
c. 滴加0.2-0.4ml DAB顯色液，室溫孵育5-30分鐘。
注：如果顯色很強(qiáng)可以短于5分鐘即停止顯色，如果顯色很弱，可以適當(dāng)延長顯色時(shí)間，甚至顯色過夜。
d. 用洗滌液洗滌3次，即可終止顯色反應(yīng)。如有必要可以使用適當(dāng)?shù)娜旧哼M(jìn)行復(fù)染，如伊紅染色液、甲基綠染色液、蘇木素染色液、DAPI染色液等。普通光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。
a. PBS ，或PBS (pH7.2-7.6)。
b. 固定液(免疫染色固定液，或4%的多聚甲醛P0099)。
c. 洗滌液(免疫染色封閉液，QuickBlock™免疫染色封閉液或，或PBS)。
d. 通透液免疫染色強(qiáng)力通透液，免疫染色洗滌液，或含0.3% Triton X-100的PBS)。
e. 內(nèi)源性過氧化物酶封閉液(內(nèi)源性過氧化物酶封閉液，甲醇或PBS配制的0.3%過氧化氫溶液)。
f. 去離子水或超純水。
g. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求：18×18mm蓋玻片，6孔板或其它多孔板。
2. 檢測體系的準(zhǔn)備
a. 如下以6孔板或常規(guī)切片檢測體系為例，如果使用12孔板、96孔板或384孔板等孔板，檢測體系可以相應(yīng)按比例縮小。
b. 如果檢測的是懸浮細(xì)胞，請按常規(guī)的懸浮細(xì)胞的操作方式進(jìn)行。例如和貼壁細(xì)胞相比，相關(guān)步驟需要增加離心步驟等。
3. 培養(yǎng)細(xì)胞的EdU標(biāo)記及固定、洗滌和通透
a. 在6孔板中(如有必要可以加入蓋玻片)培養(yǎng)適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)過夜并且恢復(fù)到正常狀態(tài)后，進(jìn)行所需的藥物處理或者其它刺激處理等。
b. 配制2X的EdU工作液：由于EdU工作液是與培養(yǎng)液等體積加入到孔板中，所以需要配制成2X的工作液。推薦的EdU終濃度為10μM (1X)，用細(xì)胞培養(yǎng)液1:500稀釋EdU (10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。
注意：對于A549、HeLa和NIH/3T3等貼壁細(xì)胞，推薦EdU的使用終濃度為10μM。但細(xì)胞類型、培養(yǎng)液種類、細(xì)胞密度、細(xì)胞增殖速度等多方面的因素會影響EdU摻入到細(xì)胞中的量，因此初次使用時(shí)建議對EdU的使用濃度進(jìn)行一定的摸索。如果之前使用過BrdU進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。
c. 將37℃預(yù)熱的2X的EdU工作液(20μM)，等體積加入6孔板中，使6孔板中的EdU終濃度變?yōu)?X。例如設(shè)計(jì)終濃度為10μM，原先6孔板中的培養(yǎng)基為1ml，則將1ml 2X的EdU工作液(20μM)加入到孔板中。如果培養(yǎng)基體積過大，可以先吸除適量的培養(yǎng)液，再加入等體積的2X的EdU工作液；或者可以減少工作液的體積并增加EdU的濃度，使最終培養(yǎng)液中的EdU濃度為10μM，例如2ml培養(yǎng)液中加入220微升0.1mM EdU。更換所有的培養(yǎng)液可能會對細(xì)胞的增殖有影響，因此不建議替換所有的培養(yǎng)液。
d. 繼續(xù)孵育細(xì)胞2小時(shí)。該孵育時(shí)間的長短取決于細(xì)胞生長速率，通常宜繼續(xù)孵育細(xì)胞周期10%左右的時(shí)間。對于常見的哺乳動物細(xì)胞如HeLa、3T3、HEK293等，細(xì)胞周期大約在18-25小時(shí)，孵育時(shí)間宜在2小時(shí)左右。人胚胎細(xì)胞的細(xì)胞周期約30分鐘，推薦的孵育時(shí)間為5分鐘；酵母細(xì)胞的細(xì)胞周期約3小時(shí)，推薦的孵育時(shí)間為20分鐘，增殖的神經(jīng)細(xì)胞其細(xì)胞周期約5天，推薦的孵育時(shí)間為1天。孵育時(shí)間小于45分鐘時(shí)，建議提高EdU的濃度；孵育時(shí)間大于20小時(shí)時(shí)，建議適當(dāng)降低EdU的濃度。
e. EdU標(biāo)記細(xì)胞完成后，去除培養(yǎng)液，并加入1ml固定液(可以使用免疫染色固定液P0098，或4%的多聚甲醛P0099)，室溫固定15分鐘。
f. 去除固定液，每孔用1ml洗滌液洗滌細(xì)胞3次，每次3-5分鐘。
g. 去除洗滌液，每孔用1ml通透液(可以使用免疫染色強(qiáng)力通透液P0097，免疫染色洗滌液P0106，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。
h. 去除通透液，每孔用1ml洗滌液洗滌細(xì)胞1-2次，每次3-5分鐘。
i. 再用內(nèi)源性過氧化物酶封閉液室溫孵育20分鐘，以滅活內(nèi)源的過氧化物酶。隨后用洗滌液洗滌3次，每次2分鐘。
j. 轉(zhuǎn)步驟5。
4. 動物體內(nèi)EdU的標(biāo)記及切片樣品的處理
EdU可以通過注射或進(jìn)食等適當(dāng)方式進(jìn)行動物的體內(nèi)標(biāo)記。如下以小鼠為例，其它動物體內(nèi)EdU的標(biāo)記請參考相關(guān)文獻(xiàn)。
a. 對于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定濃度，腹腔注射、特定組織或器官局部注射或者加入飲用水中。具體用量跟所用動物的種類、體重和使用方式有關(guān)，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)，因此初次使用時(shí)建議對EdU的使用濃度進(jìn)行一定的摸索，或者直接使用50mg/kg的濃度進(jìn)行測試。如果之前使用過BrdU進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。EdU可以單獨(dú)購買。
b. 4小時(shí)后或根據(jù)特定實(shí)驗(yàn)確定的適當(dāng)時(shí)間后，快速處死小鼠，取出所需的組織，按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片。EdU標(biāo)記的時(shí)間也可以參考相關(guān)文獻(xiàn)自行調(diào)整。
c. 對于冰凍切片：
(a) 加入適量固定液(可以使用免疫染色固定液，或4%的多聚甲醛)，室溫固定15分鐘。
(b) 去除固定液，用適量洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
(c) 去除洗滌液，用適量通透液(可以使用免疫染色強(qiáng)力通透液，免疫染色洗滌液，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。
(d) 去除通透液，用適量洗滌液洗滌1-2次，每次3-5分鐘。
(e) 抗原修復(fù)(選做)：如果同時(shí)需要進(jìn)行目的蛋白的免疫熒光染色，并有必要進(jìn)行抗原修復(fù)，可以使用適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液，例如冰凍切片快速抗原修復(fù)液(5X)，或者自行配制的適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)處理。
(f) 用內(nèi)源性過氧化物酶封閉液室溫孵育20分鐘，以滅活切片內(nèi)源的過氧化物酶。隨后用洗滌液洗滌3次，每次2分鐘。
(g) 轉(zhuǎn)步驟5。
d. 對于石蠟切片：
(a) 脫蠟：二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘，換新的無水乙醇3分鐘。95%乙醇3分鐘。85%乙醇3分鐘。75%乙醇3分鐘。50%乙醇3分鐘。PBS 5分鐘。
(b) 抗原修復(fù)(選做)：如果同時(shí)需要進(jìn)行目的蛋白的免疫組化染色，可以使用適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液，例如檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(50X)、改進(jìn)型檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(50X)、 EDTA抗原修復(fù)液(50X)、檸檬酸鈉-EDTA抗原修復(fù)液(40X)、通用型強(qiáng)力抗原修復(fù)液(10X)、漂片抗原修復(fù)液(10X)，或者自行配制適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)處理。
特別注意：如果使用蛋白酶K或胰酶進(jìn)行抗原修復(fù)，必須反復(fù)洗滌干凈，否則殘留的酶會嚴(yán)重干擾后續(xù)標(biāo)記反應(yīng)。
(c) 用內(nèi)源性過氧化物酶封閉液室溫孵育20分鐘，以滅活切片內(nèi)源的過氧化物酶。隨后用洗滌液洗滌3次，每次2分鐘。
(d) 轉(zhuǎn)步驟5。
5. EdU檢測
注意：本步驟六孔板中每孔的反應(yīng)體系為500μl的反應(yīng)混合物。對于12、24、48、96和384孔板，每孔的反應(yīng)的體系分別為200μl、100μl、70μl、50μl和20μl的反應(yīng)混合物。對于較小的孔，單位培養(yǎng)面積的液體用量已經(jīng)適當(dāng)增加，以有效避免液體蒸發(fā)可能帶來的負(fù)面影響。對于切片，可以根據(jù)切片大小，每個(gè)切片使用100-200μl的反應(yīng)混合物。如下以六孔板中的細(xì)胞樣品為例說明具體的操作方法，對于其它孔板或切片，僅每步溶液的用量按比例調(diào)整即可，其余方法相同。
a. 配制Click Additive Solution：對于，用1.3ml去離子水溶解一管Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution；對于，加入10.4ml去離子水溶解試劑盒中提供的一瓶Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution。配制后可以適當(dāng)分裝，并-20℃保存。
b. 參考下表配制Click反應(yīng)液。注意：請嚴(yán)格按照下表中組分順序和體積配制Click反應(yīng)液，否則點(diǎn)擊反應(yīng)可能無法有效進(jìn)行；同時(shí)，Click反應(yīng)液須在配制后15分鐘內(nèi)使用。
| 組分 | 6孔板樣品數(shù) | ||||||
| 1 | 2 | 4 | 5 | 10 | 25 | 50 | |
| Click Reaction Buffer | 440μl | 880μl | 1.8ml | 2.2ml | 4.4ml | 11ml | 22ml |
| CuSO4 | 10μl | 20μl | 40μl | 50μl | 100μl | 250μl | 500μl |
| Biotin Azide | 1μl | 2μl | 4μl | 5μl | 10μl | 25μl | 50μl |
| Click Additive Solution | 50μl | 100μl | 200μl | 250μl | 500μl | 1.25ml | 2.5ml |
| 總體積 | 500μl | 1ml | 2ml | 2.5ml | 5ml | 12.5ml | 25ml |
d. 每孔加入0.5ml Click反應(yīng)液，輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)混合物可以均勻覆蓋樣品。
e. 室溫避光孵育30分鐘。孵育時(shí)需注意在多孔板的空隙中加水，或者對于切片宜使用濕盒(例如載玻片染色盒)來保持濕潤，以盡量減少反應(yīng)液的蒸發(fā)。
f. 吸除Click反應(yīng)液，用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
6. Streptavidin-HRP工作液和DAB顯色液的配制：
a. Streptavidin-HRP工作液的配制：
參考下表配制適量的Streptavidin-HRP工作液，須充分混勻。注意：配制好的Streptavidin-HRP工作液必須一次使用完畢，不宜凍存。
| 組分 | 6孔板樣品數(shù) | ||||||
| 1 | 2 | 4 | 5 | 10 | 25 | 50 | |
| Streptavidin-HRP | 4μl | 8μl | 16μl | 20μl | 40μl | 100μl | 200μl |
| Streptavidin-HRP稀釋液 | 196μl | 392μl | 784μl | 980μl | 1.96ml | 4.9ml | 9.8ml |
| Streptavidin-HRP工作液 | 200μl | 400μl | 800μl | 1ml | 2ml | 5ml | 10ml |
按照每個(gè)樣品使用0.2-0.4ml顯色液的比例配制適量DAB顯色液。等體積混合適量DAB顯色液A和DAB顯色液B，充分混勻后即為DAB顯色液。注意：配制好的DAB顯色液必須一次使用完畢，不宜凍存。
7. 樣品的顯色：
a. 在樣品上加200μl Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30分鐘。
注意：Streptavidin-HRP工作液的用量以完全覆蓋樣品為準(zhǔn)。孵育時(shí)需注意在多孔板的空隙中加水，或者對于切片宜使用濕盒(例如載玻片染色盒)來保持濕潤，以盡量減少Streptavidin-HRP工作液的蒸發(fā)。
b. 用洗滌液洗滌3次，每次2分鐘。
c. 滴加0.2-0.4ml DAB顯色液，室溫孵育5-30分鐘。
注：如果顯色很強(qiáng)可以短于5分鐘即停止顯色，如果顯色很弱，可以適當(dāng)延長顯色時(shí)間，甚至顯色過夜。
d. 用洗滌液洗滌3次，即可終止顯色反應(yīng)。如有必要可以使用適當(dāng)?shù)娜旧哼M(jìn)行復(fù)染，如伊紅染色液、甲基綠染色液、蘇木素染色液、DAPI染色液等。普通光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。
標(biāo)簽：
細(xì)胞增殖檢測(DAB法)
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