點(diǎn)突變簡(jiǎn)介及其對(duì)表型變化的影響

基因點(diǎn)突變指只有一個(gè)堿基對(duì)發(fā)生改變�；螯c(diǎn)突變是基因突變的一種類型，是生物進(jìn)化的動(dòng)力來源之一，具有隨機(jī)性、低頻性和可逆性等特點(diǎn)�；螯c(diǎn)突變所產(chǎn)生的基因組SNP變異是人類疾病發(fā)生、生理生化表型差異的內(nèi)在原因之一。迄今，已有眾多的研究表明，點(diǎn)突變能使人類對(duì)癌癥、聽力疾病、精神病等多種疾病的易感性增加。因而了解點(diǎn)突變作用機(jī)制對(duì)疾病治療與預(yù)防具有重要意義。

基因點(diǎn)突變可以發(fā)生在基因組任意位置上，能對(duì)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能、基因的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制等產(chǎn)生影響。今天我們就看一看在基因組上不同區(qū)域發(fā)生的點(diǎn)突變是如何影響基因的功能和產(chǎn)生突變表型的。

在功能蛋白的編碼區(qū)發(fā)生的點(diǎn)突變
點(diǎn)突變發(fā)生在功能蛋白的基因編碼區(qū)中，這是我們所熟知的一種點(diǎn)突變的情況，能對(duì)多肽鏈中氨基酸序列產(chǎn)生影響。一般包括同義突變、錯(cuò)義突變、無義突變和終止密碼突變。

1. 同義突變：
當(dāng)堿基置換后，變換成另一個(gè)密碼子。由于mRNA翻譯的過程中存在簡(jiǎn)并密碼子，因而突變前、后密碼子所編碼的氨基酸不變，故實(shí)際上不會(huì)發(fā)生突變效應(yīng)。例如DNA鏈中的“AGT”的第三位堿基“T”突變?yōu)?ldquo;C”，則mRNA的密碼子由“TCA”變?yōu)?ldquo;TCG”。由于“TCA”和“TCG”都是編碼絲氨酸的密碼子，所以突變前后的蛋白質(zhì)相同。

2. 錯(cuò)義突變：
堿基對(duì)的置換使mRNA的某一個(gè)密碼子變成編碼另一種氨基酸的密碼子的突變稱為錯(cuò)義突變。錯(cuò)義突變可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)某種蛋白質(zhì)或酶在結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，降低蛋白質(zhì)的活性，甚至完全喪失功能。如較為熟悉的鐮刀型紅細(xì)胞貧血，其病因就是由于基因點(diǎn)突變所造成的。正常血紅蛋白β鏈的第六位是谷氨酸，其密碼子為GAA或GAG，如果第二個(gè)堿基A被U替代，就變成GUA或GUG，谷氨酸則被纈氨酸所替代，形成異常的血紅蛋白S而發(fā)病。

3. 無義突變：
由于點(diǎn)突變使原先編碼氨基酸的密碼子變?yōu)榻K止密碼子，使得多肽鏈合成提前終止，產(chǎn)生沒有生物活性的多肽鏈。從而影響了原蛋白的生物學(xué)功能。

4. 終止密碼突變：
基因中一個(gè)終止密碼突變?yōu)榫幋a某個(gè)氨基酸的密碼子的突變稱為終止密碼突變。由于肽鏈合成直到下一個(gè)終止密碼出現(xiàn)才停止，因而合成了過長(zhǎng)的多肽鏈。

在內(nèi)含子區(qū)發(fā)生的點(diǎn)突變
內(nèi)含子在真核生物中占據(jù)很大的比例，其序列特性能提供剪切信號(hào)來影響轉(zhuǎn)錄本的剪切加工。因而當(dāng)點(diǎn)突變發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)時(shí)能影響剪切位點(diǎn)的活性，且可能影響轉(zhuǎn)錄本的剪切，繼而影響蛋白質(zhì)序列，產(chǎn)生突變表型。

在基因調(diào)控區(qū)域的點(diǎn)突變
基因調(diào)控區(qū)域存在多種順式調(diào)控原件，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、衰減子等。這些順式調(diào)控原件是轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，它們通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而精確調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的起始和轉(zhuǎn)錄效率。如果點(diǎn)突變發(fā)生在這些區(qū)域中，就會(huì)導(dǎo)致與調(diào)控因子的結(jié)合能力發(fā)生改變，從而影響正常的基因表達(dá)。在研究TERT啟動(dòng)子對(duì)黑色素瘤的調(diào)控機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，TERT啟動(dòng)子發(fā)生點(diǎn)突變會(huì)影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合活性，繼而改變下游基因的表達(dá)，從而促進(jìn)黑色素瘤的發(fā)生 [1]。
 

圖 1. TERT啟動(dòng)子突變后能提高轉(zhuǎn)錄活性 [1]

（a）TERT啟動(dòng)子的點(diǎn)突變位點(diǎn)。chr5：1295228C>T(C228T)和chr5：1295250C>T(C250T)。（b）通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)野生型和突變型的TERT啟動(dòng)子活性。與A375、RPMI-7951、UACC-62、T24或HepG2細(xì)胞系中的野生型啟動(dòng)子相比，這兩種突變?cè)?種不同細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄活性都增加了約2-4倍。

在基因間隔間的點(diǎn)突變
在功能基因的間隔存在眾多的非編碼RNA。這些非編碼RNA對(duì)下游的功能基因具有調(diào)控作用，當(dāng)點(diǎn)突變發(fā)生在此處，則會(huì)影響非編碼RNA的生成和識(shí)別下游靶基因的能力，繼而影響下游功能基因的表達(dá)，產(chǎn)生突變表型。在人類miR-96突變引起非綜合征性進(jìn)行性聽力損失的報(bào)道中[2]，患者因miR-96成熟序列的第五個(gè)堿基或第六個(gè)堿基發(fā)生突變而產(chǎn)生聽力障礙。發(fā)生SNP突變的miR-96在莖環(huán)結(jié)構(gòu)形成大的突起，使其無法大量表達(dá)（圖2），并且miR-96對(duì)靶基因mRNA的識(shí)別能力降低（圖3）。
 

圖2. miR96點(diǎn)突變導(dǎo)致其前體穩(wěn)定性降低而降低其表達(dá)量 [2]

（a）野生型和突變型的miR96前體（Pre-miR96）二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。突變型miR96前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)分別在第13或第14個(gè)堿基處有突起，且miR96前體二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能上升（野生型Initial dG=-34.40,突變型Initial dG=-27.30或-27.80）。預(yù)測(cè)結(jié)果表明突變型miR96前體二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性降低。（b）RNA Blot檢測(cè)miR96成熟體的表達(dá)量。將野生型和突變型的miR96前體裝載進(jìn)psiUx plasmid，并轉(zhuǎn)染HeLa cells表達(dá)miR96成熟體，通過設(shè)計(jì)特異性探針檢測(cè)其表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)野生型miR96前體的HeLa cells的miR96成熟體表達(dá)量最高。表明突變型miR96前體二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性降低會(huì)影響miR96成熟體的表達(dá)量。
 

圖3. miR96點(diǎn)突變導(dǎo)致其對(duì)靶基因的識(shí)別能力降低 [2]

（a）野生型和突變型miR96與靶基因mRNA的配對(duì)情況。（b）熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR96點(diǎn)突變降低其對(duì)靶基因的識(shí)別能力。五個(gè)靶基因3’UTR靶區(qū)域序列裝載進(jìn)pGL3載體中，通過共轉(zhuǎn)染野生型和突變型siR96計(jì)算熒光素酶活性。結(jié)果表明miR96點(diǎn)突變降低其對(duì)靶基因的識(shí)別能力。

作為基因改變相關(guān)疾病最主要的誘因，針對(duì)點(diǎn)突變的研究不論是在先天的遺傳疾病還是后天突變導(dǎo)致的腫瘤中都具有重要的意義。由于人類疾病中基因產(chǎn)物并非總是如轉(zhuǎn)基因一樣的高表達(dá)，也不是像基因敲除一樣完全不表達(dá)。很多情況下只是由于單個(gè)或者少數(shù)幾個(gè)堿基的改變而造成的蛋白結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為非正常激活或者抑制。因此，構(gòu)建精細(xì)的與疾病對(duì)應(yīng)的點(diǎn)突變模型便成為了疾病臨床前研究的最佳方案。

賽業(yè)生物長(zhǎng)期致力于基因編輯細(xì)胞和動(dòng)物模型的建立，擁有經(jīng)驗(yàn)豐富的專家團(tuán)隊(duì)和成熟穩(wěn)定的技術(shù)平臺(tái)，可以根據(jù)您的需求提供優(yōu)質(zhì)的點(diǎn)突變模型：

Smart-CRISPR™細(xì)胞基因編輯系統(tǒng)：賽業(yè)生物基于CRISPR-Cas9技術(shù)自主開發(fā)的Smart-CRISPR™細(xì)胞基因編輯系統(tǒng)，采取更有效的設(shè)計(jì)方案，高同源重組效率和無隨機(jī)插入細(xì)胞基因組的風(fēng)險(xiǎn)，適用于多種細(xì)胞，成功率高，經(jīng)大量測(cè)試和優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)工藝，可以更快交付基因敲入和點(diǎn)突變細(xì)胞株，加速您的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展！

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]Horn S, Figl A, Rachakonda PS, et al. TERT promoter mutations in familial and sporadic melanoma. Science. 2013;339(6122):959-961.

[2]Mencia A, Modamio-Hoybjor S, Redshaw N, et al. Mutations in the seed region of human miR-96 are responsible for nonsyndromic progressive hearing loss [J]. Nature Genetics, 2009, 41 (5): 609-613.