分子膠&PROTACs熱門靶點CRBN的介紹及其在臨床研究中的應(yīng)用

2月28日，致力于分子膠理性篩選及設(shè)計的Magnet Biomedicine宣布與禮來達成合作和許可協(xié)議，以發(fā)現(xiàn)、開發(fā)和商業(yè)化腫瘤分子膠藥物。此次合作將利用Magnet的TrueGlue™發(fā)現(xiàn)平臺（結(jié)合了最先進的篩選技術(shù)、專有的化學(xué)文庫），以鑒定能實現(xiàn)蛋白誘導(dǎo)鄰近的分子膠，靶向難成藥靶點。

3月12日，Arvinas和輝瑞（Pfizer）公司聯(lián)合宣布其明星PROTAC分子vepdegestrant的首個關(guān)鍵3期臨床試驗結(jié)果，并指出該款藥物是首個在3期試驗中展現(xiàn)出臨床獲益的PROTAC分子。

那什么是分子膠？什么是PROTAC？在此之前，小編先給大家詳細介紹一下靶向蛋白降解技術(shù)。

01 靶向蛋白降解技術(shù)
在藥物研發(fā)領(lǐng)域，靶向蛋白降解（targeted protein degradation，TPD）技術(shù)近年來發(fā)展迅猛，正在開啟藥物研發(fā)的新紀元。該技術(shù)能夠針對傳統(tǒng)小分子抑制劑或抗體藥物難以觸及的蛋白靶點發(fā)揮效力，使那些曾被認定為“不可成藥”的靶點變得可及，從而顯著拓展了可靶向的疾病機制和適應(yīng)癥范圍。靶向蛋白降解劑是一類能夠促使特定蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)被降解的藥物或化合物。這種降解通常是通過細胞自身的降解系統(tǒng)（如泛素-蛋白酶體途徑）實現(xiàn)的。

知識小課堂
泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）是一種主要的蛋白質(zhì)降解途徑，參與真核細胞內(nèi)80%以上蛋白質(zhì)的降解。UPS由泛素（ubiquitin, Ub）、泛素活化酶（ubiquitinactivating enzyme, E1）、泛素結(jié)合酶（ubiquitinconjugating enzyme, E2）、泛素連接酶（ubiquitinprotein ligase, E3）、蛋白酶體及其底物（蛋白質(zhì)）構(gòu)成。UPS通過多個連續(xù)反應(yīng)降解靶蛋白。
 

圖1.  泛素蛋白酶體系統(tǒng)的示意圖^[1]

在ATP依賴的第一步中，E1結(jié)合并激活泛素。而后泛素被轉(zhuǎn)移到E2上，形成E2-泛素中間體。E3連接酶結(jié)合中間蛋白和底物蛋白，催化泛素和底物蛋白之間形成異肽鍵，以完成底物蛋白的泛素化和多聚泛素化。泛素化的蛋白質(zhì)被特定的蛋白酶體識別并結(jié)合，最終在蛋白酶的催化下蛋白質(zhì)分解為短肽或氨基酸。

在靶向蛋白降解劑中，PROTAC（proteolysis targeting chimeras）和分子膠（Molecular Glue）是近年來備受關(guān)注的革命性藥物開發(fā)策略。

02 分子膠
分子膠（Molecular Glue）并非雙功能分子，它通常是一種結(jié)合在E3連接酶上的小分子化合物。它們通過改變E3連接酶的表面結(jié)構(gòu)，使其能夠與原本不結(jié)合的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，進而促進目標蛋白的降解。
 

圖2. 分子膠結(jié)構(gòu)及其作用機制^[2]

03 PROTAC
PROTAC，即蛋白水解靶向嵌合體，通過連接靶蛋白和E3連接酶，誘導(dǎo)靶蛋白泛素化降解。其本質(zhì)是一種雙功能分子，一端與需要降解的致病蛋白特異性結(jié)合，另一端則可以募集E3連接酶，通過搭建“靶蛋白-PROTAC-E3連接酶”三元復(fù)合物，促使泛素分子標記靶蛋白，最終由蛋白酶體將其降解。
 

Cereblon（CRBN）是蛋白質(zhì)降解研究中最廣泛研究的靶點。作為Cullin 4 RING E3泛素連接酶（CRL4）的底物識別受體，CRBN與DDB1、Cullin 4（CUL4A或CUL4B）和Ring-Box 1（RBX1）共同形成CRL4^CRBN復(fù)合物。

目前PROTACs和分子膠主要使用的CRBN配體仍然是免疫調(diào)節(jié)抑制劑，如來那度胺（Lenalidomide），沙利度胺（Thalidomide）和泊馬度胺（Pomalidomide）。但是這些化合物都會存在一些缺陷，如易消旋和易降解neosubstrate等，所以人們一直在開發(fā)新型的CRBN配體。

04 CRBN靶點藥物研發(fā)現(xiàn)狀
據(jù)不完全統(tǒng)計，全球處于在研階段的與CRBN的藥物有數(shù)十個，主要涉及PROTAC和分子膠。適應(yīng)癥主要集中在血液腫瘤（如多發(fā)性骨髓瘤）、實體瘤、自身免疫性疾�。ㄈ缦到y(tǒng)性紅斑狼瘡）等領(lǐng)域

Fig.1 Detection of CRBN expression in spleen, brain, liver, intestine and muscle tissues by RT-PCR.
Wild type: only one band at 185 bp with primers F1/R1 (mCrbn);
Homozygous: one band at 262 bp with primers F2/R2 (hCRBN) and one band at 374 bp with primers F3/R3 (hCRBN);
Abbr. M, DNA marker; HO, homozygous; WT, wild type.

WB檢測人CRBN表達
 

Fig.2 Expression characterization of hCRBN in homozygous hCRBN KI mice by Western blot.

WB檢測GSPT1, CK1a and Myc表達

CC-885作為是一種CRBN調(diào)節(jié)劑，在多種腫瘤細胞中具有抗增殖活性。CC-885可以誘導(dǎo)IKZF1降解，還可以促進CRBN與新型底物GSPT1的結(jié)合，靶向其降解。
 

Fig.4 Blood concentration curves of Lenalidomidein in C57BL/6 and HO hCRBN mice (female, 10wks, n=3).（In cooperation with a client）

Fig.5 Blood concentration of CC-885 in C57BL/6 and hCRBN mice 1h after first administration (female, 10wks). (In cooperation with a client）

In vivo efficacy study

Fig.6 Mean body weight (A) and survival curve (B) of C57BL/6 and HO hCRBN KI mice treated with CC-885 or vehicle (n=8/group). 

Fig.7 The degradation of GSPT1, CK1a and Myc by CC-885 in C57BL/6 and hom hCRBN knockin mice in vivo (In cooperation with a client).

The wild-type C57BL/6 (WT, group 1&2) and homozygous hCRBN KI (HO, group 3&4) mice were treated with vehicle (group 1&3)  and 5 mg/kg CC-885 (group 2&4) , respectively. The mice were anesthetized, perfused, and tissues were harvested at 6 hr post the 2nd administration.

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Reference：
1. Yamamoto J, Ito T, Yamaguchi Y, Handa H. Discovery of CRBN as a target of thalidomide: a breakthrough for progress in the development of protein degraders. Chem Soc Rev. 2022;51(15):6234-6250. Published 2022 Aug 1. doi:10.1039/d2cs00116k
2. Weagel, E.G., Foulks, J.M., Siddiqui, A. et al. Molecular glues: enhanced protein-protein interactions and cell proteome editing. Med Chem Res 31, 1068–1087 (2022). https://doi.org/10.1007/s00044-022-02882-2
3. Thapa R, Bhat AA, Gupta G, et al. CRBN-PROTACs in Cancer Therapy: From Mechanistic Insights to Clinical Applications. Chem Biol Drug Des. 2024;104(5):e70009. doi:10.1111/cbdd.70009

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