Npc1基因敲除小鼠助力揭示尼曼匹克病C型蛋白1在肝細(xì)胞癌中的作用

肝癌是全球范圍內(nèi)一項(xiàng)重大的健康挑戰(zhàn)，其發(fā)病率正在不斷上升。肝細(xì)胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌中最常見的類型，約占所有肝癌病例的90%。HCC的治療面臨著復(fù)發(fā)率高、生存期短等難題，而現(xiàn)有的治療手段效果并不理想。因此，迫切需要深入研究驅(qū)動(dòng)HCC進(jìn)展的分子機(jī)制，以便發(fā)現(xiàn)新的診斷標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)。

之前的研究發(fā)現(xiàn)，HCC中的膽固醇穩(wěn)態(tài)受到嚴(yán)重破壞。NPC1（尼曼匹克病C型蛋白1）是一種與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)，在HCC中具有較高的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。作為一種大的跨膜蛋白，NPC1主要定位在晚期內(nèi)體/溶酶體膜上，被認(rèn)為與膽固醇代謝和病毒感染（如埃博拉病毒）相關(guān)。不過，它在HCC中的確切作用仍不清楚。

近日，國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（北京）姜穎課題組與賀福初院士團(tuán)隊(duì)利用基因敲除（KO）小鼠模型闡明了NPC1在HCC發(fā)生和發(fā)展中的作用。他們發(fā)現(xiàn)，NPC1通過控制TGFBR1蛋白的穩(wěn)定性來調(diào)控TGF-β通路，進(jìn)而促進(jìn)HCC進(jìn)展，而這種機(jī)制與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)無關(guān)。這項(xiàng)成果發(fā)表在《Nature Communications》雜志上，提出了以NPC1為靶點(diǎn)的HCC治療策略。

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員使用了多個(gè)小鼠模型來研究NPC1的作用，包括小鼠皮下腫瘤模型和尾靜脈轉(zhuǎn)移模型以及DEN/CCl₄誘導(dǎo)的HCC模型（Cre^AlbNpc1^F/F和Npc1^F/F小鼠由賽業(yè)生物提供）。他們還構(gòu)建了他莫昔芬誘導(dǎo)的肝特異性Npc1基因敲除小鼠模型和MYC驅(qū)動(dòng)的自發(fā)HCC小鼠模型。他們使用了過表達(dá)NPC1和穩(wěn)定敲降NPC1的多個(gè)HCC細(xì)胞系，并開展了細(xì)胞增殖、遷移和侵襲分析。此外，他們還通過環(huán)己酰亞胺追蹤實(shí)驗(yàn)和泛素化分析來檢測(cè)TGFBR1蛋白的穩(wěn)定性。

技術(shù)路線

通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)估NPC1在HCC中的功能
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通過蛋白質(zhì)組學(xué)等分析探索NPC1促進(jìn)HCC進(jìn)展的機(jī)制，以及是否與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān)
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探索NPC1對(duì)TGFBR1蛋白穩(wěn)定性的影響，以及NPC1通過何種機(jī)制影響TGFBR1蛋白的穩(wěn)定性
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通過多個(gè)小鼠模型來驗(yàn)證NPC1在調(diào)控TGF-β通路和HCC進(jìn)展中的作用

研究結(jié)果
NPC1促進(jìn)了HCC進(jìn)展
研究人員首先分析了癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)在52%的癌癥類型（包括HCC）中，NPC1在腫瘤組織中顯著上調(diào)。與癌旁組織相比，NPC1在HCC組織中的蛋白和mRNA水平均顯著升高。NPC1高表達(dá)患者的總生存期（OS）和無病生存期（DFS）明顯低于NPC1低表達(dá)患者。這些結(jié)果顯示，NPC1在HCC中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

接下來，研究人員通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)NPC1在HCC中的功能進(jìn)行了評(píng)估。他們使用了過表達(dá)NPC1的PLC/PRF/5細(xì)胞以及敲降NPC1的HepG2和MHCC-97H細(xì)胞。他們發(fā)現(xiàn)，NPC1過表達(dá)顯著增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而NPC1的沉默則顯著降低了這些能力。在回補(bǔ)NPC1后，這兩種細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲能力幾乎完全恢復(fù)。

為了進(jìn)一步探討NPC1在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中的作用，他們采用了小鼠皮下腫瘤模型和尾靜脈轉(zhuǎn)移模型。在皮下瘤模型中，NPC1基因敲降導(dǎo)致腫瘤大小和重量顯著減少；在尾靜脈轉(zhuǎn)移模型中，NPC1基因敲降導(dǎo)致肺部腫瘤轉(zhuǎn)移顯著減少，進(jìn)一步證明了它在腫瘤轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用。這些結(jié)果顯示，NPC1是促進(jìn)HCC進(jìn)展的關(guān)鍵因子。

NPC1以不依賴膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的方式調(diào)控TGF-β通路
為了探究NPC1促進(jìn)HCC進(jìn)展的機(jī)制，研究人員對(duì)敲降NPC1的PLC/PRF/5和HepG2細(xì)胞進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。通路富集分析表明，NPC1敲降顯著抑制了HCC細(xì)胞中的TGF-β通路激活，并導(dǎo)致TGFBR1、p-SMAD2和p-SMAD3蛋白水平下降（圖1）。從功能上講，敲降NPC1降低了HCC細(xì)胞的遷移能力（圖1）。這些結(jié)果表明，NPC1在促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移的過程中主要調(diào)控了SMAD2/3的激活。

值得注意的是，在敲降NPC1后，回補(bǔ)NPC1的P691S突變體（膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)活性缺失）仍能恢復(fù)TGFBR1和p-SMAD2的水平以及細(xì)胞遷移能力（圖1），表明NPC1調(diào)控TGF-β通路的方式與其膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)功能無關(guān)。

圖1. NPC1以不依賴膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的方式調(diào)控TGF-β通路

NPC1增加TGFBR1蛋白的穩(wěn)定性并抑制其泛素化
后續(xù)的環(huán)己酰亞胺追蹤實(shí)驗(yàn)表明，NPC1在HCC細(xì)胞中的過表達(dá)延長了TGFBR1的半衰期，而NPC1的敲降則加速了TGFBR1的降解，強(qiáng)調(diào)NPC1在穩(wěn)定TGFBR1蛋白水平中發(fā)揮作用。利用蛋白酶體抑制劑MG132處理后，他們發(fā)現(xiàn)TGFBR1蛋白水平顯著增加，表明NPC1對(duì)TGFBR1降解的調(diào)控是由蛋白酶體介導(dǎo)的。此外，NPC1降低了Lys 48連接的多泛素化水平，而這種泛素化與蛋白酶體降解相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，NPC1通過抑制Lys 48連接的泛素化，減少了TGFBR1的蛋白酶體降解，進(jìn)而穩(wěn)定了TGFBR1。

通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞共定位分析，研究人員證實(shí)了NPC1與TGFBR1存在相互作用，且TGFBR1-NPC1復(fù)合物主要存在于溶酶體中（圖2）。進(jìn)一步分析表明，NPC1上的氨基酸692-854區(qū)域負(fù)責(zé)與TGFBR1結(jié)合。在穩(wěn)定敲降NPC1的HCC細(xì)胞中，回補(bǔ)NPC1（P691S）可恢復(fù)TGFBR1表達(dá)和細(xì)胞遷移，但回補(bǔ)NPC1（Δ692-854）則無法挽救這些表型（圖2）。

他們推測(cè)NPC1可能通過調(diào)節(jié)TGFBR1與SMAD7或E3連接酶的相互作用來抑制其泛素化。后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn)，NPC1過表達(dá)減少了TGFBR1與SMAD7及E3泛素酶SMURF1/2的相互作用（圖2）。這些結(jié)果表明，NPC1通過與TGFBR1相互作用并抑制其與SMAD7和SMURF1/2的結(jié)合，保護(hù)TGFBR1免受蛋白酶體降解。

圖2. NPC1與TGFBR1相互作用并抑制其與SMAD7/SMURF的結(jié)合

通過對(duì)286對(duì)人類HCC組織樣本的檢測(cè)，研究人員發(fā)現(xiàn)NPC1與TGFBR1的表達(dá)之間存在明顯的正相關(guān)。為了探索NPC1是否通過TGFBR1激活來促進(jìn)HCC進(jìn)展，他們利用TGFBR1抑制劑（LY2157299）來處理過表達(dá)NPC1的PLC/PRF/5細(xì)胞。這種處理可明顯減弱NPC1誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移增強(qiáng)。此外，在小鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移模型中，過表達(dá)TGFBR1挽救了NPC1敲降細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛力。這些結(jié)果表明，TGFBR1對(duì)NPC1介導(dǎo)的促進(jìn)HCC進(jìn)展至關(guān)重要。

肝臟NPC1缺失抑制TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)并限制HCC進(jìn)展
最后，研究人員還委托賽業(yè)生物構(gòu)建了肝特異性的Npc1條件性基因敲除小鼠（Cre^AlbNpc1^F/F）和對(duì)照小鼠（Npc1^F/F），并通過DEN-CCl₄誘導(dǎo)了HCC模型。他們發(fā)現(xiàn)，在注射DEN 24周后，對(duì)照組小鼠出現(xiàn)了巨大的肝臟腫瘤，而Cre^AlbNpc1^F/F小鼠的腫瘤大小和數(shù)量均明顯下降（圖3）。在MYC驅(qū)動(dòng)的自發(fā)HCC小鼠模型以及他莫昔芬誘導(dǎo)的Npc1基因敲除小鼠模型中，他們獲得了類似的結(jié)果。

染色結(jié)果顯示，Cre^AlbNpc1^F/F小鼠腫瘤中的侵襲性標(biāo)志物減少。更重要的是，Npc1基因敲除導(dǎo)致TGFBR1及其下游效應(yīng)物p-SMAD2的表達(dá)減少，這也印證了NPC1在調(diào)控TGF-β信號(hào)通路中的作用。同時(shí)，Cre^AlbNpc1^F/F小鼠的生存時(shí)間延長。這些結(jié)果有力地證明了NPC1在調(diào)控TGF-β通路和促進(jìn)HCC進(jìn)展中的作用，突出了NPC1的治療潛力。
 

圖3. 肝臟NPC1缺失抑制HCC腫瘤發(fā)生和進(jìn)展

結(jié)論

圖4. NPC1調(diào)控TGF-β信號(hào)通路的示意圖

這項(xiàng)研究利用肝細(xì)胞中缺失Npc1的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，確定了NPC1在肝細(xì)胞癌中的促腫瘤作用。NPC1與TGFBR1相互作用，阻礙其與SMAD7/SMURF復(fù)合物的結(jié)合，進(jìn)而減少TGFBR1的泛素化。通過穩(wěn)定TGFBR1蛋白，NPC1調(diào)控了TGF-β信號(hào)通路，并促進(jìn)了癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移（圖3），而這與其在膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用無關(guān)。這些結(jié)果不僅揭示了HCC進(jìn)展背后的分子機(jī)制，也表明NPC1有望成為HCC的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

原文檢索
Li, S., Yan, L., Li, C. et al. NPC1 controls TGFBR1 stability in a cholesterol transport-independent manner and promotes hepatocellular carcinoma progression. Nat Commun 16, 439 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-024-55788-5