細(xì)胞活性測定的五大方法操作大全

各位老師在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候會不會很好奇 “要怎么判斷細(xì)胞是死是活呢？它們活的好嗎?”
逍鵬生物手把手來教您如何進(jìn)行判斷。

可以簡單將分析細(xì)胞活力和增殖測定的方法分成5大類：
●   代謝增殖測定
●   DNA合成增殖實(shí)驗(yàn)
●   化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性測定
●   熒光染料增殖實(shí)驗(yàn)
●   臺盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)
以下簡單介紹這些分類的幾種常見實(shí)驗(yàn)方式吧！

 

代謝增殖測定

MTT檢測法
活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶，能使額外添加的MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，死細(xì)胞則無此現(xiàn)象。接著用二甲基亞砜（DMSO）溶解沉積在細(xì)胞中的甲瓚后，可利用酶標(biāo)儀490nm波長測光吸收值，依據(jù)吸光值（OD值）計(jì)算出活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，吸光值與細(xì)胞活性成正比。
 

△ 圖例

 

XTT檢測法
與MTT原理相似，皆是利用添加物與活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，并利用酶標(biāo)儀測定產(chǎn)物光吸收值；不同于MTT法的是，XTT法還原產(chǎn)物是水溶性的橙黃色甲肷，不需經(jīng)過二甲基亞砜（DMSO）溶解步驟，即可直接測定光吸收值（BI，貨號：20-300-1000），操作較MTT方便快速。當(dāng)XTT與電子耦合劑作用后產(chǎn)生的水溶性甲肷吸光值與活細(xì)胞數(shù)成正比。

△ 圖例

 

DNA合成增殖實(shí)驗(yàn)

BrdU檢測法
BrdU為胸腺嘧啶核苷（Thymine）的衍生物，可用于標(biāo)記活細(xì)胞中新合成的DNA（細(xì)胞活性周期S期），BrdU可隨著DNA復(fù)制進(jìn)入子細(xì)胞，因此在加入BrdU后分裂增殖的細(xì)胞DNA都會帶有BrdU標(biāo)記，可通過抗BrdU單克隆抗體檢測，借此檢測細(xì)胞的增殖能力，但BrdU單克隆抗體檢測過程需要將部分DNA變性，使部分雙股解開成單股才能順利檢測。且BrdU為光敏性，因此需要在光線刺激較低（黑暗）的環(huán)境下操作，并避光培養(yǎng)。

△ 圖例

 

EdU檢測法
EdU原理跟BrdU檢測法很像，都是代替胸腺嘧啶（Thymine，T）滲入正在復(fù)制的DNA中，并加入能與EdU反應(yīng)的熒光染料，即可利用檢測熒光值偵測細(xì)胞增殖，或在細(xì)胞組織級別作為標(biāo)記追蹤等研究，實(shí)驗(yàn)過程不需要經(jīng)過BrdU檢測法的DNA變性處理。

△ 圖例

 

化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性測定

ATP發(fā)光法
ATP是細(xì)胞的能量直接來源，ATP發(fā)光法是通過檢測細(xì)胞內(nèi)ATP含量來分析細(xì)胞增殖。市面上的原理是利用外源的螢火蟲熒光素（Luciferin）與熒光素酶（Luciferase），以細(xì)胞內(nèi)含的ATP為能量來源，發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生生物冷光，因此可通過監(jiān)測冷光光度，來對應(yīng)ATP含量并判斷細(xì)胞增殖狀況。

△ 圖例

 

熒光染料增殖實(shí)驗(yàn)

CFSE檢測法
CFSE是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，具有細(xì)胞膜通透性，能夠自由進(jìn)入細(xì)胞；當(dāng)CFSE擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜，會與細(xì)胞內(nèi)源酯酶產(chǎn)生水解反應(yīng)而被激發(fā)，發(fā)出綠色熒光，這些帶熒光的CFSE會進(jìn)一步與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合，形成穩(wěn)定的胞內(nèi)熒光蛋白。每當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖，胞內(nèi)熒光蛋白會被平均分配到下一代細(xì)胞中，因此細(xì)胞熒光強(qiáng)度會隨著增殖代數(shù)增加而不斷地降低，可用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步檢測分析得出細(xì)胞分裂增殖的情況。CFSE的濃度，對于最終判斷細(xì)胞增殖結(jié)果有直接性的影響。

△ 圖例

 

臺盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)

臺盼藍(lán)（Trypan Blue）計(jì)數(shù)法
臺盼藍(lán)（BI，貨號：03-102-1B）是一種藍(lán)色細(xì)胞活性染料，無法通過結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部；但細(xì)胞死后，喪失細(xì)胞膜穩(wěn)定性，臺盼藍(lán)會進(jìn)入細(xì)胞將細(xì)胞染成藍(lán)色，因此在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，常規(guī)地搭配自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或血球計(jì)數(shù)板，應(yīng)用于分辨活細(xì)胞和死細(xì)胞、及檢測細(xì)胞膜的完整性。

△ 圖例

 

Orangu™細(xì)胞計(jì)數(shù)

Orangu™計(jì)數(shù)法
Orangu™ solution（Cell Guidance，貨號：OR01-500）是一種無細(xì)胞毒性、高靈敏度、比色法，用于測定細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的細(xì)胞活性試劑。利用WST-8（細(xì)胞代謝的一種水溶性的四唑鹽）在細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶作為電子介質(zhì)的情況下，它被還原為橙色的甲瓚染料，且產(chǎn)生甲瓚染料的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量和培養(yǎng)時(shí)間成正比。操作簡單快速，結(jié)果可重復(fù)。

△ 圖例
 

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