細(xì)胞容易污染的解決與測定方法

很多老師在進行細(xì)胞培養(yǎng)實驗時，細(xì)胞總是會莫名其妙的就被污染了，同樣的實驗人員，同樣的環(huán)境，同樣的培養(yǎng)體系，可是細(xì)胞還是有污染。
試劑、耗材已經(jīng)使用控制變量法進行過排查，那么還有什么方面可能會導(dǎo)致污染呢？

 ———— 細(xì)胞房環(huán)境污染（空氣中的沉降菌）

 

Vol.1
有關(guān)沉降菌的術(shù)語與定義

沉降菌
通過使用專門的培養(yǎng)基，并按照以下標(biāo)準(zhǔn)提及的方法，收集空氣中的活微生物粒子，在適宜的條件下，繁殖到肉眼可見的菌落數(shù)。通過自然沉降原理收集在空氣中的生物粒子于培養(yǎng)基平皿，經(jīng)若干時間，在適宜的條件下讓其繁殖到可見的菌落進行計數(shù)，以平板培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)來判定潔凈環(huán)境內(nèi)的活微生物數(shù)，并以此來評定潔凈室（區(qū)）的潔凈度。

沉降菌菌落數(shù)
規(guī)定時間內(nèi)每個平板培養(yǎng)皿收集到空氣中沉降菌的數(shù)目，以個/皿表示。

靜態(tài)a
潔凈室（區(qū)）在凈化空氣調(diào)節(jié)系統(tǒng)已安裝完畢且功能完備的情況下，生產(chǎn)工藝設(shè)備已安裝、潔凈室（區(qū)）內(nèi)沒有生產(chǎn)人員的狀態(tài)。

靜態(tài)b
潔凈室（區(qū)）在生產(chǎn)操作全部結(jié)束，生產(chǎn)操作人員撤離現(xiàn)場并經(jīng)過20min 自凈后。

動態(tài)
潔凈室（區(qū)）已處于正常生產(chǎn)狀態(tài)，設(shè)備在指定的方式下進行，并且有指定的人員按照規(guī)范操作。

標(biāo)準(zhǔn)：
1. GB/T 16292-2010 《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）》懸浮粒子的測試方法》
2. GB/T 16294-2010 《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）》沉降菌的測試方法》
 

Vol.2
如何進行檢測

1. 實驗準(zhǔn)備
試劑：大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）

圖1. 大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基

 

布置要求：
采樣點布置宜力求均勻，避免采樣點在局部區(qū)域過于稀疏；細(xì)胞房、安全柜、超凈臺建議下列布置圖：

圖2.平面采樣點布置圖

參照醫(yī)藥工業(yè)潔凈室沉降菌的測試方法細(xì)胞房、安全柜、超凈臺建議布置圖中，我們選取五點取樣法。（大家可根據(jù)實驗室情況進行選擇，具體沒有規(guī)定限制取樣布置圖）

圖3. 生物安全柜布置圖
 

最小培養(yǎng)皿數(shù)：

注：常規(guī)超凈臺或安全柜潔凈度級別：100級；常規(guī)細(xì)胞房潔凈度級別：10000級；這里的最小培養(yǎng)皿數(shù)是所有采樣點皿數(shù)總和。

3. 生物安全柜、細(xì)胞房及開放環(huán)境測試步驟
 

生物安全柜

① 選擇狀態(tài)：
●  靜態(tài)a測試時：生物安全柜應(yīng)開機運行不少于10min；細(xì)胞房凈化空氣調(diào)節(jié)系統(tǒng)正常運行時間不少于30min后開始。 
●  靜態(tài)b測試時：生物安全柜宜在操作人員撤離現(xiàn)場并經(jīng)過10min自凈后開始；細(xì)胞房宜在操作人員撤離現(xiàn)場并經(jīng)過20min自凈后開始。
●  動態(tài)測試：則須記錄生產(chǎn)開始的時間以及測試時間。

② 培養(yǎng)皿表面必須嚴(yán)格消毒，將培養(yǎng)皿按采樣點布置圖逐個放置，然后從里到外逐個打開培養(yǎng)皿蓋（避免人衣物上微生物的掉落干擾實驗），使培養(yǎng)基表面暴露在空氣中。
●  靜態(tài)測試時，培養(yǎng)皿暴露時間在30min以上，室內(nèi)測試人員不得多于2人。
●  動態(tài)測試時，培養(yǎng)皿暴露時間為不大于4h。

圖4. 桌面

圖5. 離心機

圖6. 顯微鏡
 

圖7. 培養(yǎng)箱
 

圖8. 傳遞窗

開放環(huán)境

圖9. 開放環(huán)境桌面放置
 

④ 全部采樣結(jié)束后，收樣時需從外到里逐個蓋上培養(yǎng)皿蓋（同樣避免人衣物上微生物的掉落干擾實驗），做好相應(yīng)標(biāo)記后將培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不少于48h。
⑤ 每批培養(yǎng)基應(yīng)有對照試驗，檢查培養(yǎng)基本身是否污染�？蛇x定每批3只培養(yǎng)皿不打開作對照培養(yǎng)。

4. 陽性對照測試
為避免無陽性對照，我們邀請技術(shù)同事將手指點涂在培養(yǎng)基上進行陽性對照實驗。兩天后可明顯觀察到菌落的生成。

圖10. 手指部位陽性對照組


圖11. 手指部位陽性對照組（放大圖）

肉眼可以觀察到明顯的菌落形成，成片的是菌落重疊生長聚集在了一起，很難分辨出具體有多少個菌落。
※  平時我們的手上會攜帶大量的菌

Vol.3
測試結(jié)果判定

可直接觀察：

圖12. 批次對照組

由圖可以看出對照組都未長菌。




圖13. 生物安全柜污染點取樣
可以看出生物安全柜無污染。



圖14. 細(xì)胞房以污染點取樣

由圖可以看出我公司細(xì)胞房內(nèi)潔凈程度達標(biāo)，無污染。

 

圖15. 開放環(huán)境桌面取樣
開放環(huán)境下，肉眼可以看到有菌落形成
 

菌落計數(shù)：
●  用肉眼對培養(yǎng)基上的所有菌落直接計數(shù)、標(biāo)記或在菌落計數(shù)器上點計，然后用5～10倍放大鏡檢查，有否遺漏。
●  若培養(yǎng)皿上有2個或2個以上菌落重疊，可分辨時仍以2個或2個以上的菌落計數(shù)。
●  平均菌落的計算，如下：

 平均菌落數(shù)M=（M1+M2+...Mn）/n

注意事項：
★  測試用具要做滅菌處理，以確保測試的可靠性、正確性
★  采取一切措施防止人為對樣本的污染。
★  對培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及其他參數(shù)作詳細(xì)的記錄。
★  由于細(xì)菌種類繁多，差別甚大，計數(shù)時一般用透射光于培養(yǎng)皿背面或正面仔細(xì)觀察，不要漏計培養(yǎng)皿邊緣生長的菌落，并須注意細(xì)菌菌落與培養(yǎng)基沉淀物的區(qū)別，必要時用顯微鏡鑒別。
★  采樣前應(yīng)仔細(xì)檢查每個培養(yǎng)皿的質(zhì)量，如發(fā)現(xiàn)變質(zhì)、破損或污染的應(yīng)剔除。
★  沉降菌檢測使用的大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基不一定適養(yǎng)支原體，所以不代表無支原體污染。

監(jiān)測頻率：
★  如果生物安全柜所處的環(huán)境為十萬級潔凈區(qū)，可每三個月測試一次;
★  如果生物安全柜所處的環(huán)境為萬級潔凈區(qū)，至少每個月監(jiān)測一次沉降菌;
★  如果沉降菌連續(xù)幾次監(jiān)測不合格，則考慮更換生物安全柜的高效過濾器。
 

 

歡迎關(guān)注公眾號留言咨詢，給您最合適的解決方案~

了解詳細(xì)信息可戳原文，轉(zhuǎn)載請標(biāo)明出處。
BI 中國市場部：上海逍鵬生物科技有限公司