顯微成像助力脊髓損傷后的軸突再生和功能恢復研究新進展

  本文作者：黃春筱 博士

同濟大學醫(yī)學院

     1.脊髓 CPG與斑馬魚模型

人和動物的行走、奔跑、游泳、爬行等運動行為被稱為脊髓軀體運動，控制脊髓軀體運動的神經中樞被稱為 “脊髓中央模式產生器 (Spinal Central Pattern Generator, 脊髓 CPG)”

圖1：脊髓中央模式產生器的作用（圖片來源于網絡）

車禍、自然災害等造成的嚴重外傷極易引發(fā)脊髓損傷，進而導致機體運動、感覺等多種功能障礙，嚴重影響患者生活質量及平均壽命，給其家庭和社會帶來極大的經濟負擔。目前臨床針對脊髓損傷的治療，依然是固定和康復治療，無法做到有效根治。

圖2：脊髓損傷（圖片來源于網絡）

因此，聚焦于脊髓損傷后的神經生長和環(huán)路重建的療法，則有望為上述患者提供更優(yōu)的治療方案。

相較于成年鼠等哺乳動物脊髓再生修復能力低下，成年斑馬魚脊髓再生能力強，損傷后4-6周便可以恢復運動功能，是研究脊髓內源性修復機制的好模型。

圖3：用于脊髓損傷研究的斑馬魚模型（圖片來源于網絡）

通過斑馬魚神經系統再生和脊髓損傷后修復的研究，可以使人們了解控制脊髓CPG中間神經元軸突再生和脊髓橫斷后局部CPG重連的內在機制。
 

     2.脊髓損傷后的軸突再生和功能恢復

2021年12月7日，同濟大學醫(yī)學院 宋建人教授，在Nature Communications雜志上在線發(fā)表了研究長文“An injury-induced serotonergic neuron subpopulation contributes to axon regrowth and function restoration after spinal cord injury in zebrafish”（一類脊髓損傷后誘導形成的5-HT神經元亞群有助于斑馬魚脊髓損傷后的軸突再生和功能恢復）。

該研究利用斑馬魚脊髓雙切斷損傷模型，在損傷部位成功發(fā)現了一類特定的5-HT神經元亞群，該群神經元細胞，只在脊髓損傷部分形成，并不受上游5-HT神經元的影響。在斑馬魚脊髓損傷后的軸突再生和運動功能恢復中起到重要作用。
在該研究中，研究人員使用了脊髓雙切斷模型，在不同時間分別切斷了斑馬魚的第7和第12節(jié)脊髓，用于觀察脊髓損傷后神經元再生情況。
研究人員借助于Tg(tph2:GFP)轉基因系，其神經元表達GFP分子，且其中97%的神經元表達血清素。將RD注射于損傷遠端部位，通過逆向標記來量化軸突再生相關脊髓中間神經元的變化（圖4），結果顯示斑馬魚脊髓損傷后再生的脊髓中間神經元，是固有的脊髓內的反應，與上游神經元無關。

圖4 免疫組化成像顯示雙切斷斑馬魚模型在不同的時間后脊髓中間神經元恢復情況

（該圖由Olympus FV3000拍攝得到）

 

利用Tg(tph2:Gal4;UAS:nfsB-mCherry)轉基因系（圖5），進一步驗證了脊髓損傷后誘導形成的單獨脊髓中間神經元即可促進神經軸突的再生、神經環(huán)路重建及運動功能的恢復。

圖5 免疫組化成像顯示雙切斷斑馬魚模型在有/無MTZ干預下脊髓中間神經元恢復情況

（該圖由Olympus FV3000拍攝得到）

研究人員利用Tg(vglut2a:Gal4;UAS:GFP) 和Tg(glyt2:GFP)轉基因斑馬魚系，對脊髓損傷后軸突再生的興奮性中間神經元和抑制性中間神經元比例進行分析，發(fā)現80%軸突再生的神經元是興奮性中間神經元（圖6）。

圖6 免疫組化成像顯示脊髓損傷后軸突再生的興奮性中間神經元和抑制性中間神經元恢復情況

（該圖由Olympus FV3000拍攝得到）

脊髓損傷誘導形成的脊髓中間神經元具有成熟神經元細胞的特性，但是又有著與損傷部位遠端神經元細胞不同的電位表現和鈣離子濃度變化情況，因此這是一群與非損傷脊髓部位內神經元不同類型的細胞。

再生的脊髓中間神經元被損傷部位遠端神經元軸突包裹纏繞，表現出更活躍的電生理特性，釋放更多的5-HT，從而促進軸突再生和環(huán)路重建（圖7）。

圖7 脊髓損傷部位全細胞膜片鉗記錄電壓變化情況

 

以上研究用充分的數據證實了脊髓內 5-羥色胺能系統的局部增強可能具備提供重建哺乳動物脊髓運動回路的潛力。

同時研究人員證實5-HT1B 受體在脊髓神經修復中具有重要作用，而損傷誘導后形成的脊髓中間神經元也會是一類潛在的治療用細胞，可以促進脊髓 CPG 的重組和脊髓損傷后運動功能的恢復。

     3.顯微成像的實驗技巧

本研究中，針對斑馬魚脊髓的高分辨率宏觀成像均采用Olympus FV3000共聚焦系統。FV3000優(yōu)異的光路設計，支持從1.25倍到150倍等不同放大倍數的物鏡，特別適合此類從宏觀到微觀觀察組織標本。

實驗過程中，可先利用低倍物鏡對整個組織樣本進行快速宏觀成像，精準定位感興趣區(qū)域；再切換至高倍物鏡，利用聚焦地形圖（Focus Map）功能，根據樣品表面高度和厚度在不同區(qū)域設置最佳焦平面，從而進行高分辨率全視野成像或局部感興趣區(qū)域成像，獲得極佳的成像效果。
整套一體化的采集流程，能夠大幅提升科研工作者的實驗效率。

 

參考文獻：

1.https://www.msdmanuals.cn/home/injuries-and-poisoning/spinal-injuries/injuries-of-the-spinal-cord-and-vertebrae

2.Huang, CX., Zhao, Y., Mao, J. et al. An injury-induced serotonergic neuron subpopulation contributes to axon regrowth and function restoration after spinal cord injury in zebrafish. Nat Commun. 12, 7093 (2021).  

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