光學(xué)切片成像技術(shù)在生物三維成像中的應(yīng)用與展望

在現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中，獲取高質(zhì)量的三維結(jié)構(gòu)和功能信息對于深入理解生物系統(tǒng)的復(fù)雜性至關(guān)重要。光學(xué)顯微鏡技術(shù)作為獲取這些信息的關(guān)鍵工具，一直在不斷地發(fā)展和創(chuàng)新。然而，生物組織的復(fù)雜性和光學(xué)成像的物理限制，使得三維成像面臨諸多挑戰(zhàn)�，F(xiàn)基于最新研究文獻(xiàn)，對光學(xué)切片技術(shù)在三維生物成像中的應(yīng)用進(jìn)行深入解讀，探討其技術(shù)創(chuàng)新、實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及未來發(fā)展方向。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
光學(xué)顯微鏡在生物成像領(lǐng)域具有不可替代的地位，它能夠提供亞微米級分辨率的三維結(jié)構(gòu)和功能信息。然而，生物組織的復(fù)雜性給三維成像帶來了諸多挑戰(zhàn)。首先，生物組織中的強(qiáng)烈散射效應(yīng)會導(dǎo)致成像質(zhì)量下降，使得遠(yuǎn)離焦點(diǎn)的熒光背景信號干擾成像。其次，成像技術(shù)還面臨時(shí)空分辨率有限、信噪比低、穿透深度不足以及光毒性高等問題。例如，共聚焦顯微鏡雖然在固定細(xì)胞成像中被廣泛使用，但其高光毒性和有限的穿透深度限制了其在活體成像中的應(yīng)用。而非線性顯微鏡雖然具有更好的穿透深度，但其時(shí)空分辨率較低，難以滿足對復(fù)雜生物組織進(jìn)行快速、高分辨率成像的需求。此外，隨著成像深度的增加，散射效應(yīng)會進(jìn)一步增強(qiáng)，導(dǎo)致成像質(zhì)量急劇下降，這也成為厚組織成像的主要障礙之一。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
共軸成像技術(shù)
共軸成像技術(shù)中，照明和檢測軸重合，導(dǎo)致焦點(diǎn)內(nèi)外信號高度混合。其中，共聚焦顯微鏡是最常用的光學(xué)切片方法之一，通過在檢測器前設(shè)置針孔來阻擋離焦信號，從而實(shí)現(xiàn)光學(xué)切片。然而，共聚焦顯微鏡的成像速度和穿透深度有限。為了提高成像速度，多焦點(diǎn)并行掃描技術(shù)被提出，通過空間光調(diào)制器或微透鏡陣列生成掃描網(wǎng)格，實(shí)現(xiàn)多點(diǎn)同時(shí)激發(fā)和檢測。此外，線共聚焦顯微鏡采用線掃描代替點(diǎn)掃描，大幅提高了成像通量，但以降低光學(xué)切片能力為代價(jià)。多光子顯微鏡則利用非線性效應(yīng)，在焦點(diǎn)處選擇性激發(fā)信號，實(shí)現(xiàn)深組織成像，但其成像速度較慢，且對樣品的光漂白較為嚴(yán)重。

非共軸成像技術(shù)
非共軸成像技術(shù)通過分離照明和檢測軸，避免了共軸成像中的焦點(diǎn)內(nèi)外信號混合問題。光片顯微鏡是典型的非共軸成像技術(shù)，通過垂直照明和檢測實(shí)現(xiàn)光學(xué)切片，具有低光毒性和高成像速率的優(yōu)點(diǎn)，適用于胚胎發(fā)育等領(lǐng)域的活體成像。然而，光片顯微鏡在厚樣品成像中，由于散射效應(yīng)的影響，成像質(zhì)量會有所下降。線照明調(diào)制顯微鏡（LiMo）等單掃描光學(xué)切片顯微鏡的出現(xiàn)，為厚組織成像提供了新的解決方案。這些方法通過線掃描成像和后期重建算法，實(shí)現(xiàn)了速度與光學(xué)切片能力的平衡，即使在器官水平也能獲得可接受的成像質(zhì)量。

成像實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析
共軸成像技術(shù)實(shí)驗(yàn)
在共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)中，使用固定細(xì)胞樣品進(jìn)行成像，結(jié)果顯示共聚焦顯微鏡能夠有效提高成像分辨率和光學(xué)切片能力，但在厚樣品成像中，其穿透深度和成像速度的不足逐漸顯現(xiàn)。多光子顯微鏡實(shí)驗(yàn)中，對活體動物大腦進(jìn)行成像，成功觀察到了單個(gè)細(xì)胞的生物活動，如鈣成像等，驗(yàn)證了其在深組織成像中的優(yōu)勢。然而，多光子顯微鏡的成像速度較慢，限制了其對快速動態(tài)過程的捕捉能力。

性能比較與分析
通過對不同技術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)共軸成像技術(shù)在薄樣品成像中具有較高的分辨率和光學(xué)切片能力，但在厚樣品成像中受到限制。而非共軸成像技術(shù)則在厚樣品成像中表現(xiàn)出更好的適應(yīng)性，能夠有效抑制背景信號，提高成像質(zhì)量。光片顯微鏡和LiMo顯微鏡等非共軸技術(shù)在成像速度和光毒性方面具有明顯優(yōu)勢，適用于活體成像和大型樣品成像。此外，不同技術(shù)在信噪比、成像深度、光安全性和后處理速度等方面也存在差異，這些因素需要根據(jù)具體的成像需求進(jìn)行綜合考慮，以選擇最適合的成像技術(shù)。

總結(jié)與展望
光學(xué)切片技術(shù)在三維生物成像中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，為生物醫(yī)學(xué)研究提供了強(qiáng)大的工具。共軸和非共軸成像技術(shù)各具特色，適用于不同的成像場景和需求。共軸成像技術(shù)如共聚焦顯微鏡和多光子顯微鏡，在高分辨率和深組織成像方面具有優(yōu)勢，但受限于成像速度和光毒性等問題。非共軸成像技術(shù)如光片顯微鏡和LiMo顯微鏡，則以其低光毒性和高成像速率，在活體成像和大型樣品成像中展現(xiàn)出獨(dú)特魅力，同時(shí)通過技術(shù)創(chuàng)新不斷克服散射等成像障礙。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和創(chuàng)新，光學(xué)切片技術(shù)將朝著更高分辨率、更深穿透深度、更低光毒性和更快成像速度的方向發(fā)展。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。

Zhang, J., Qiao, W., Jin, R. et al. Optical sectioning methods in three-dimensional bioimaging. Light Sci Appl 14, 11 (2025). 

DOI:org/10.1038/s41377-024-01677-x.