Cell：Inscopix新發(fā)現(xiàn)--中腦調(diào)控運動現(xiàn)象對帕金森癥的新啟示

運動對于所有生物個體都十分重要，從動物基本的覓食行為，到躲避天敵的逃跑行為，這些都受到大腦神經(jīng)環(huán)路的支配，那么是否還有很多關于大腦調(diào)控運動的未解之謎呢？
科研發(fā)現(xiàn)神經(jīng)環(huán)路控制身體運動和協(xié)調(diào)四肢的位置起到十分重要的作用，對于帕金森病也有著十分重要的意義。

中腦運動區(qū)（MLR）以前被認為只控制脊椎動物的行走和其他形式的運動，近期由瑞士巴塞爾大學Friedrich Michel生物醫(yī)學研究所和生物中心發(fā)表在Cell上的題為“Functional diversity for body actions in the mesencephalic locomotor region.”的文章，在這項對小鼠的研究中，發(fā)現(xiàn)中腦運動區(qū)也調(diào)節(jié)姿勢變化和其他運動。這項新研究通過使用Inscopix自由行為顯微鈣成像系統(tǒng)觀察中腦運動區(qū)（MLR）神經(jīng)元不同群體的興奮性發(fā)現(xiàn)兩種在空間上混雜的谷氨酸能群體——一種連接脊髓，一種連接基底神經(jīng)節(jié)。這項新的研究表明，那些直接連接到脊髓的細胞參與調(diào)節(jié)身體伸展和姿勢變化，這可能是啟動運動所必需的，還可能對緩解藥物無效的帕金森病患者的姿勢和步態(tài)問題具有啟示意義。
正文

運動對于所有物種的生存都至關重要，是整個身體的地面移動的方法。它使人們能夠與環(huán)境進行多種形式的可控互動，包括探索，如尋找食物，以及應對緊急的反應，如逃離危險。無論選擇何種運動形式，其成功完成都需要整個身體進行受控的姿勢調(diào)整，協(xié)調(diào)四肢以實現(xiàn)身體的轉(zhuǎn)移，以及有效抑制與運動不相容的其他肢體動作。這些行為觀察提出了一個現(xiàn)象，即涉及運動和其他形式身體運動的選擇和調(diào)節(jié)的潛在神經(jīng)元環(huán)路機制。
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中腦運動區(qū)域(MLR)通過整合了許多輸入的信息并投射到下行和上行的靶點，結(jié)合了運動調(diào)節(jié)的各種重要屬性。MLR的歷史定義是功能性的，對它的電刺激可以引發(fā)全身運動，速度和步態(tài)隨著刺激強度的增加而增加。在這些觀察之后，出現(xiàn)了一些與MLR功能相關的問題，即如何確定MLR的精確位置以及如何確定負責觀察到的效應的神經(jīng)元類型。解剖學上，MLR的功能定義包括中腦區(qū)域，包括腳前額核（PPN）、楔狀前核和楔狀核的吻尾毗鄰區(qū)（pCnF和CnF）以及相鄰的中腦網(wǎng)狀結(jié)構（mRT）。這些區(qū)域包含混合的谷氨酸和GABA能神經(jīng)元，PPN也包含膽堿能神經(jīng)元，需要一種策略來解剖和理解MLR功能的位置和神經(jīng)遞質(zhì)身份。

PPN的研究具有臨床意義。應用PPN腦深部刺激（DBS）改善帕金森病步態(tài)和平衡癥狀產(chǎn)生了不同的發(fā)現(xiàn)。在一篇綜述文章強調(diào)，盡管多年來一直在進行臨床研究，但PPN區(qū)域的功能多樣性可能是缺乏改善帕金森�。≒D）癥狀的應用策略共識的關鍵原因（Garcia Rill et al.，2019）�？傊�，雖然CnF-vGlut2神經(jīng)元可以在逃逸環(huán)境中驅(qū)動運動，但相鄰區(qū)域（包括PPN）功能的結(jié)果無法協(xié)調(diào)。這些不同的觀察結(jié)果強調(diào)，鑒于只有一小部分MLR神經(jīng)元編碼運動，有必要更好地描述該中腦區(qū)域的功能性神經(jīng)元多樣性，也涉及其他運動行為。此外，在運動中考慮速度調(diào)節(jié)和肢體協(xié)調(diào)之外的其他方面也很重要，要知道它的成功執(zhí)行還需要姿勢調(diào)整和其他運動程序的抑制。

在這里，作者基于目標連接可能與功能相關的前提，確定并功能性解剖谷氨酸能MLR亞群。作者發(fā)現(xiàn)，空間鄰近的MLR-vGlut2神經(jīng)元根據(jù)軸突靶點、轉(zhuǎn)基因標記物表達、神經(jīng)元活動和行為中的作用分離不同的神經(jīng)元群。脊柱投射群體（MLR>SC）不同于以Rbp4Cre轉(zhuǎn)基因（MLR-Rbp4）特異標記的基底節(jié)輸出結(jié)構為靶點的上升群體。雖然MLR>SC神經(jīng)元在直立過程中受到正向調(diào)節(jié)，但MLR-Rbp4神經(jīng)元主要在前肢行為抓取和梳理過程中呈現(xiàn)興奮性。光遺傳學實驗證明了MLR>SC神經(jīng)元在身體伸展中的作用，同時指出了MLR-Rbp4神經(jīng)元在調(diào)節(jié)各種行為中的作用。作者得出結(jié)論，功能不同的MLR亞群的接近可能解釋了谷氨酸能MLR神經(jīng)元的不同結(jié)果，并為設計新策略以改善涉及PPN區(qū)域的PD癥狀提供了重要信息。

結(jié)果

MLR-vGlut2神經(jīng)元單獨的下行和上行群體

作者首先通過下行和/或上行投射確定谷氨酸能MLR神經(jīng)元的精確位置。作者將具有Cre依賴性條件表達和逆行神經(jīng)元靶向潛能（rAAV）的腺相關病毒（AAVs）（Tervo等人，2016）注射到選擇的下行和上行MLR投射靶中。作者提供了表達不同標記蛋白的RAAV，這些標記蛋白靶向細胞核（nTag），以便檢測細胞體的位置。作者通過向vGlut2Cre小鼠注射rAAV-flex-nTag變體，將分析局限于谷氨酸能MLR神經(jīng)元（圖1A）。為了用下行投射靶向MLR-vGlut2神經(jīng)元，作者將rAAV-flex-nTag1和-Tag2分別注入延髓網(wǎng)狀結(jié)構（Med）和SC（見STAR方法）。作為MLR-vGlut2神經(jīng)元的主要上升靶點，作者將rAAV-flex-nTag3注入嚙齒動物的主要基底節(jié)輸出結(jié)構——黑質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構（SNr）（Oorschot，1996；Smith等人，1998年）（圖1A）。
Rbp4Cre轉(zhuǎn)基因標記具有SN投射的谷氨酸能MLR神經(jīng)元

緊鄰膽堿能PPN神經(jīng)元的谷氨酸能SN投射神經(jīng)元群促使作者確定是否能找到遺傳途徑進入這些神經(jīng)元。作者將AAV-PHP.eB-flex-nTag病毒（一種AAV變體，有效地轉(zhuǎn)導神經(jīng)系統(tǒng)）全身注射到表達Cre重組酶的現(xiàn)有小鼠系中（Chan等人，2017年）。作者發(fā)現(xiàn)，用于靶向大腦皮層第5層錐體束（PT）神經(jīng)元的轉(zhuǎn)基因小鼠系Rbp4Cre（Gerfen et al.，2013）也在緊鄰膽堿能PPN神經(jīng)元的神經(jīng)元群中表現(xiàn)出選擇性表達（圖2A）。MLR-Rbp4神經(jīng)元的定量顯示，mRT和PPN亞區(qū)的分布情況比pCnF和CnF更為明顯，吻尾側(cè)分布情況與谷氨酸能MLR>SN神經(jīng)元的分布情況一致（圖2A）。
谷氨酸能MLR亞群的差異作用調(diào)節(jié)

針對下行和上行興奮性MLR神經(jīng)元群的可能性，通過Inscopix自由行為顯微鈣成像系統(tǒng)來監(jiān)測它們的活動，在曠場測試中記錄動物自由活動行為期間的神經(jīng)發(fā)放情況（圖3A）。之前的研究表明，部分MLR-vGlut2神經(jīng)元的活動可以跟蹤運動狀態(tài)，作者首先評估了是否檢測到在運動發(fā)作期間優(yōu)先活躍的神經(jīng)元。為了確定行為期間的神經(jīng)元活動變化，作者計算了研究行為期間的平均熒光，并減去未檢測到行為的幀期間的平均熒光，從而得出與靜止事件相比分配給每個神經(jīng)元的行為調(diào)制指數(shù)。作者發(fā)現(xiàn)，在運動過程中，只有一小部分神經(jīng)元在運動過程中受到正調(diào)制，這一特性與MLR>SC比MLR-Rbp4神經(jīng)元更相關（MLR>SC:39.3%；MLR-Rbp4:19.9%）。

這些發(fā)現(xiàn)提出了MLR>SC和MLR-Rbp4神經(jīng)元是否在其他行為中出現(xiàn)興奮性的問題。因此，作者跟蹤了其他頻繁自發(fā)行為的發(fā)生——在曠場中直立、梳理和抓取食物（圖3B）。通過使用高速視頻和加速度傳感器數(shù)據(jù)的監(jiān)督學習算法識別行為事件（圖3C）。通過分析MLR>SC神經(jīng)元的反應（圖3D-3H），作者發(fā)現(xiàn)與直立開始相關的熒光信號增加（圖3E）。相比之下，運動的開始或前肢行為的抓取和梳理并未導致總體MLR>SC群體的發(fā)放增加（圖3E）。

接下來，作者確定了單個MLR>SC神經(jīng)元的調(diào)制指數(shù)及其在四種分析行為中的分布。作者發(fā)現(xiàn)，在直立過程中，MLR>SC神經(jīng)元的發(fā)放明顯，而在其他三種行為中，只有少數(shù)神經(jīng)元受到強烈的正向調(diào)節(jié)（圖3F和3G）。因此，同樣在單神經(jīng)元水平上，直立過程中的積極調(diào)節(jié)的影響，而在其他行為中的調(diào)節(jié)影響可以在一些神經(jīng)元中檢測到，但要小得多（圖3E-3G）。作者還通過單神經(jīng)元和單次試驗分析（圖3D）研究了神經(jīng)元活動與直立期之間的關系。單個MLR>SC神經(jīng)元在時間和大小上表現(xiàn)出不同的動力學，這在分析在同一行為時間幀上在一只小鼠中成像的多個MLR>SC神經(jīng)元時可以特別清楚地看出（圖3D）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明MLR>SC神經(jīng)元更傾向于直立。
MLR神經(jīng)元群體的行為差異解碼

為了進一步探索神經(jīng)元活動特征與不同行為之間的關系，作者采用了相反的方法。作者提取了所有分析神經(jīng)元的神經(jīng)元活動的峰值，并計算了在峰值時間（圖4A）或特定時間內(nèi)發(fā)生的每種行為的概率-單個神經(jīng)元的時間窗口為2.5s至+5s（圖4B）。作者發(fā)現(xiàn)，MLR>SC神經(jīng)元在動物直立期間強烈反應的概率高，其次是行走，但在抓取和梳理期間很少發(fā)現(xiàn)峰值（圖4A和4B）。相比之下，MLR-Rbp4神經(jīng)元的活動峰值與抓取相關，其次是梳理，而行走和直立表現(xiàn)得很弱（圖4A和4B）。總之，這些發(fā)現(xiàn)支持了以下觀察：大多數(shù)MLR>SC神經(jīng)元在全身行為期間反應，而MLR-Rbp4神經(jīng)元在前肢的抓取和梳理行為期間表現(xiàn)出的反應。
MLR>SC神經(jīng)元調(diào)節(jié)身體伸展

接下來，作者通過功能互補性缺失和增強實驗研究了MLR>SC和MLR-Rbp4神經(jīng)元在行為中的作用�？紤]到MLR>SC和MLR-Rbp4群體均表現(xiàn)出與多種行為相關的復雜調(diào)節(jié)特性的觀察結(jié)果，預測每個整體群體的光遺傳學擾動，以測試神經(jīng)元活動的聯(lián)合下調(diào)或上調(diào)對行為輸出的影響。
MLR-Rbp4神經(jīng)元通過影響基底神經(jīng)節(jié)來調(diào)節(jié)行為

為了確定MLR-Rbp4神經(jīng)元在行為中的作用，作者通過在Rbp4神經(jīng)元中表達stGtACR2來進行功能缺失實驗（圖6A）。作者推斷，急性降低MLR-Rbp4神經(jīng)元的神經(jīng)元活動可能導致行為的普遍去抑制，因為對促進基底節(jié)輸出結(jié)構的行為抑制的興奮性驅(qū)動減少（圖2和S2）。MLR-Rbp4神經(jīng)元的雙側(cè)光遺傳抑制確實導致身體運動不協(xié)調(diào)（圖6B；視頻S2）。光遺傳學誘導的運動包括整個試驗中具有高度可變運動序列的所有身體部位（圖6B、S7A和S7B；視頻S2），與刺激時小鼠的特定運動無關（數(shù)據(jù)未顯示）。作者發(fā)現(xiàn)，當光刺激仍在進行時，異常光誘導運動停止，并且在激光偏移時或之后未觀察到額外的過度運動（圖6C、S7A和S7B；視頻S2）。對照組小鼠的光照不會引起跟蹤身體部位的速度變化（圖S7A）�？傊�，這些研究結(jié)果表明，MLR-Rbp4神經(jīng)元的光遺傳學抑制導致全身各部位運動輸出的快速失調(diào)，這可能是由于MLR-Rbp4神經(jīng)元和基底節(jié)輸出結(jié)構之間的生理調(diào)信號受到干擾。
討論

運動是一種普遍的動物行為，涉及分布式神經(jīng)元環(huán)路。MLR的累積研究已經(jīng)引發(fā)了關于理解其在自然運動行為中的功能討論，但DBS在難治性PD癥狀方面的應用還不清楚。在這里，作者展示了專門的神經(jīng)元群在不同形式的身體運動中有反應。作者相信，這些發(fā)現(xiàn)為正在進行的爭論提供了線索，并呼吁從根本上更新對中腦區(qū)域的神經(jīng)元功能的觀點。作者將利用inscopix系統(tǒng)繼續(xù)研究中腦神經(jīng)元對運動系統(tǒng)功能和DBS干預設計的影響

參考文獻:

Ferreira-Pinto MJ, Kanodia H, Falasconi A, Sigrist M, Esposito MS, Arber S. Functional diversity for body actions in the mesencephalic locomotor region. Cell. 2021

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