神經(jīng)性厭食癥嚙齒動(dòng)物模型的建立方法和注意事項(xiàng)

 

神經(jīng)性厭食癥(AN)是一種以食物攝入過(guò)度限制、過(guò)度運(yùn)動(dòng)和對(duì)體重增加的非理性恐懼為特征的精神疾病。作為最致命的精神疾病之一，AN迄今尚無(wú)公認(rèn)的藥理學(xué)治療方法，且對(duì)該疾病的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制和影響知之甚少。本研究擬在介紹一種動(dòng)物模型，以探索與該疾病標(biāo)志性癥狀相關(guān)的神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)化學(xué)變化。

實(shí)驗(yàn)介紹

在此，我們介紹了一種在雌性青春期小鼠中誘導(dǎo)基于活動(dòng)的厭食癥(ABA)的方案。ABA是一種通過(guò)對(duì)有轉(zhuǎn)輪的嚙齒動(dòng)物實(shí)施食物限制而誘發(fā)的多動(dòng)狀態(tài)。這種現(xiàn)象被用作研究神經(jīng)性厭食癥潛在神經(jīng)生物學(xué)的模型。

神經(jīng)性厭食癥(AN)是一種以熱量攝入過(guò)度限制和異常高水平的體力活動(dòng)為特征的精神疾病。由于缺乏對(duì)潛在神經(jīng)生物學(xué)的理解，AN是一種需要治療的挑戰(zhàn)性疾病，在精神疾病中死亡率最高。為了滿足這一需求，神經(jīng)科學(xué)家正在使用動(dòng)物模型來(lái)研究神經(jīng)回路如何導(dǎo)致AN的易感性并可能受到AN的影響�；�于活動(dòng)的厭食癥(ABA)是嚙齒動(dòng)物中描述的一種生物行為現(xiàn)象，可模擬神經(jīng)性厭食癥的關(guān)鍵癥狀。當(dāng)嚙齒動(dòng)物可以自由地在轉(zhuǎn)輪上進(jìn)行自愿運(yùn)動(dòng)時(shí)，它們會(huì)受到食物限制，變得過(guò)度活躍——比可以自由獲得食物的動(dòng)物跑得更多。

在此，我們描述了在青春期雌性C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)ABA的程序。在出生后第36天(P36)，將動(dòng)物關(guān)在籠舍內(nèi)，讓其可以在轉(zhuǎn)輪上進(jìn)行自愿鍛煉。在適應(yīng)轉(zhuǎn)輪4天后，在P40上，從籠中取出所有食物。在接下來(lái)的3天里，每天將食物放回籠中2小時(shí)(允許動(dòng)物自由取食物)。第四天限食后，將食物放回原處，并將轉(zhuǎn)輪從籠中取出，以便動(dòng)物恢復(fù)。連續(xù)多天對(duì)轉(zhuǎn)輪活動(dòng)的分析表明，小鼠在食物限制開始后24小時(shí)內(nèi)變得過(guò)度活躍。老鼠甚至在它們有食物的有限時(shí)間內(nèi)奔跑。此外，車輪運(yùn)行的晝夜節(jié)律模式被食物限制的經(jīng)歷所擾亂。我們已經(jīng)能夠?qū)⑸窠?jīng)生物學(xué)變化與動(dòng)物車輪行駛行為的各個(gè)方面相關(guān)聯(lián)，以將特定的大腦區(qū)域和神經(jīng)化學(xué)變化與食物限制誘發(fā)的過(guò)度活躍的恢復(fù)力和易感性聯(lián)系起來(lái)。

實(shí)驗(yàn)方法

注意:本方案已針對(duì)青春期雌性C57BL/6小鼠進(jìn)行了優(yōu)化。將動(dòng)物飼養(yǎng)在室溫保持在72±2°且室溫濕度保持在50%±10%的設(shè)施中。每天早上7點(diǎn)至晚上7點(diǎn)房間燈亮著。

準(zhǔn)備帶跑輪的籠子

1. 將計(jì)算機(jī)和 USB 接口集線器設(shè)置在動(dòng)物收容室的安全區(qū)域，遠(yuǎn)離自來(lái)水和人流，但距離籠架足夠近，可以在發(fā)射器的無(wú)線范圍內(nèi)。確保計(jì)算機(jī)和 USB 接口集線器都從墻上插座獲得電源，并且 USB 接口集線器通過(guò) USB 電纜連接到計(jì)算機(jī)。使用備用電源設(shè)備為計(jì)算機(jī)和 USB 集線器供電。
2. 使用跑輪設(shè)備隨附的 USB 電纜將計(jì)算機(jī)連接到 USB 接口集線器。
3. 啟動(dòng)計(jì)算機(jī)并通過(guò)雙擊圖標(biāo)啟動(dòng)跑輪軟件。
4. 將三節(jié) AAA 電池安裝到每個(gè)運(yùn)行車輪的底座中，并確認(rèn)車輪管理器軟件已識(shí)別發(fā)射器。在“車輪傳感器”標(biāo)題下列出程序窗口中的每個(gè)車輪。
5. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)的特定規(guī)范設(shè)置數(shù)據(jù)采集的配置。
6. 為每個(gè)老鼠準(zhǔn)備一個(gè)籠子，包括床上用品、巢穴、免費(fèi)取水和跑輪。通常，每個(gè)實(shí)驗(yàn)使用 8 只小鼠進(jìn)行神經(jīng)解剖學(xué)研究。行為研究可能需要更多的小鼠，以確保足夠的統(tǒng)計(jì)能力。
7. 確保運(yùn)行輪能夠在不接觸任何籠壁、食物籃或籠頂?shù)那闆r下自由移動(dòng)。轉(zhuǎn)動(dòng)每個(gè)輪子幾次，并確認(rèn)軟件正在更新每個(gè)輪子的輪數(shù)。

適應(yīng)階段

1. 將每個(gè)老鼠（雌性 C57BL/6 鼠標(biāo)；年齡 P36）單獨(dú)放在一個(gè)帶有運(yùn)行輪的籠子中。
2. 將預(yù)先稱重的干糧（約 100 克）添加到食品料斗中，并將一個(gè)預(yù)先稱重的滿容器（約 50 克）的濕糧放入籠中。
3. 在程序窗口中，通過(guò)選擇“文件”菜單中的“開始采集”選項(xiàng)開始車輪活動(dòng)數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)。選擇要保存數(shù)據(jù)的目錄。該軟件將連續(xù)記錄車輪的轉(zhuǎn)數(shù)，直到手動(dòng)停止實(shí)驗(yàn)。
4. 每天在房間內(nèi)關(guān)燈時(shí)稱量動(dòng)物、濕糧和干糧。如果重量低于 50 克，請(qǐng)重新裝滿干糧，如果食物變干或被墊料弄臟，請(qǐng)更換濕糧容器。每天此時(shí)也要手動(dòng)記錄輪數(shù)，以防數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)丟失。

開始食物限制

1. 在食物限制的第一天中午（或房間燈計(jì)劃關(guān)閉前 7 小時(shí)）從籠子里取出所有干濕食物。
2. 在同一天，在黑暗周期開始時(shí)，記錄動(dòng)物的重量和輪數(shù)。將預(yù)先稱重的干糧（約 50 克）放入食品料斗，將預(yù)先稱重的濕糧（約 5 克）放入稱重船的籠子中。
3. 為每只動(dòng)物準(zhǔn)備一個(gè)帶有床上用品和小窩的新鮮籠子。
4. 2小時(shí)后，將運(yùn)行輪轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備好的新鮮籠子。這種籠子更換可確保動(dòng)物在下一次喂食之前保持食物限制，以防一些食物碎屑掉落或被囤積在床上用品中。為了減少更換籠子的壓力，從舊籠子中加入兩把（約 500 毫升）弄臟的墊料，然后將動(dòng)物移入新籠子。
5. 記錄剩余的濕糧和干糧的重量，以確定食用的食物量。記錄食物獲取期結(jié)束時(shí)的輪數(shù)。

食品限制期間監(jiān)測(cè)動(dòng)物健康

1. 每天，在黑暗周期開始時(shí)，記錄動(dòng)物的重量和輪數(shù)。將預(yù)先稱重的干濕食物放在籠子里。
2. 如果動(dòng)物的體重在限制食物之前低于其初始體重的 75%，則將其從實(shí)驗(yàn)中移除。
   注：過(guò)度饑餓的其他跡象包括駝背姿勢(shì)和無(wú)法在籠子周圍移動(dòng)。動(dòng)物可能摸起來(lái)很冷，并且在 2 小時(shí)的食物訪問(wèn)期間不能進(jìn)食。
3. 為每只動(dòng)物準(zhǔn)備一個(gè)帶有床上用品和小窩的新鮮籠子。
4. 2小時(shí)后，將運(yùn)行輪轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備好的新鮮籠子。從舊籠子中加入兩把（約 500 毫升）弄臟的墊料，然后將動(dòng)物移入新籠子。
5. 記錄剩余的濕糧和干糧的重量，以確定食用的食物量。記錄食物獲取期結(jié)束時(shí)的輪數(shù)。

結(jié)束實(shí)驗(yàn)

1. 三天的食物限制后，結(jié)束 ABA 實(shí)驗(yàn)。安樂(lè)死動(dòng)物以收集腦組織，或讓動(dòng)物在進(jìn)行額外的行為測(cè)試之前恢復(fù)。
2. 單擊程序窗口中文件菜單下的“結(jié)束采集”選項(xiàng)。
3. 從籠子上拆下運(yùn)行的輪子，并從軸距上拆下電池。
4. 如果讓動(dòng)物恢復(fù)，將預(yù)先稱重的干糧返回食品料斗，并允許動(dòng)物在恢復(fù)期間隨意獲取食物。

數(shù)據(jù)分析

1. 將實(shí)驗(yàn)的所有車輪數(shù)據(jù)保存在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)選擇的目錄中的 .wls 文件中。
2. 通過(guò)選擇“文件”菜單中的“導(dǎo)出”選項(xiàng)將數(shù)據(jù)導(dǎo)出到電子表格。在“源數(shù)據(jù)文件”選項(xiàng)中選擇所需的 .wls 文件。選擇開始和結(jié)束日期和時(shí)間，然后在車輪傳感器列表中選擇要導(dǎo)出的每個(gè)車輪傳感器。

注意事項(xiàng)

1、為了盡量減少老鼠行為數(shù)據(jù)中的噪音，重要的是盡量減少動(dòng)物所經(jīng)歷的不可預(yù)測(cè)的壓力。例如，應(yīng)盡量減少對(duì)動(dòng)物的處理，僅在稱重時(shí)干擾動(dòng)物。

2、處理動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)者應(yīng)該接受過(guò)訓(xùn)練并且對(duì)處理動(dòng)物感到舒適。

3、應(yīng)避免使用氣味和香水。

4、稱重和送餐的時(shí)間應(yīng)盡可能有規(guī)律，以盡量減少任何不可預(yù)測(cè)性。

5、如果要使用不同的小鼠品系、性別或年齡組，則可能需要修改協(xié)議的某些參數(shù)

 

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